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《浙江大学》 2005年
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螺旋藻染色体外DNA的克隆及结构与功能研究

曹学成  
【摘要】:本论文以钝顶螺旋藻藻株Sp-H01、Sp-D、Sp-J、Sp-Z、Sp-S、Sp-T、Sp-10等为材料,建立了螺旋藻染色体外DNA(exDNA)提取与纯化的技术方法;研究了exDNA的基本分子特征;通过Southerm杂交分析了各种exDNA之间及exDNA与螺旋藻染色体DNA之间的同源性;克隆并测定了Sp-S两种exDNA的部分序列,进而对它们的一级结构和二级结构,以及开放阅读框(ORF)编码蛋白的结构与功能作了生物信息学分析。结果如下:1 螺旋藻exDNA的高效提取与纯化技术方法的建立 采用多种方法从螺旋藻中提取exDNA,通过比较与分析,建立了一种高效提取螺旋藻exDNA的方法—CTAB-蛋白酶K法。该方法在藻细胞裂解液和第一次DNA沉淀物的溶解中均加入适量的蛋白酶K,再经酚/氯仿/异戊醇等抽提,可有效去除蛋白质和多糖等杂质,使exDNA的质量和提取率均显著提高。利用所建方法对10多株钝顶螺旋藻所作的exDNA提取结果显示:(1)多数藻株只含有一种exDNA,如Sp-H01的exDNA约为0.75kb,Sp-D、Sp-J和Sp-Z等的exDNA约为1.1 kb~1.2 kb;(2)少数藻株含有两种exDNA,如Sp-S含有1.8kb和3.6kb的两种exDNA,依次简称为exDNA-S-S和exDNA-S-L;Sp-T含有1.9kb和3.8 kb两种exDNA,分别简称为exDNA-T-S和exDNA-T-L。同时,针对螺旋藻exDNA的丰度低,难以富集与纯化等问题,本文在比较凝胶冻融过滤法、DNA凝胶回收试剂盒和碱法等方法的基础上,确立以凝胶冻融过滤法回收与纯化exDNA的效果最好,回收率高于90%。2 螺旋藻exDNA的基本分子特征 对exDNA所作的遗传稳定性、分子构型及酶切图谱等研究结果显示:(1)exDNA在螺旋藻生长繁殖过程中保持稳定遗传;(2)通过碱变性或热变性处理,发现变性的螺旋藻exDNA可以迅速复性,经UV照射后电泳条带呈弥散状而不形成新的DNA条带;采用10种限制性内切酶对exDNA进行的酶切表明,exDNA可以部分地为DraI酶切,但未形成酶切带型,说明螺旋藻exDNA可能是一类具有复杂结构的线性DNA分子;(3)2D琼脂糖凝胶电泳分析结果表明,Sp-S和Sp-T各自所含的两种exDNA不是同一种质粒的两种构型,而是两种各自独立的遗传元件。3 螺旋藻基因组DNA的限制性酶酶切分析 对提取螺旋藻基因组DNA的CTAB二次沉淀法进行了改进,通过提高DNA沉淀缓冲
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:Q943.2

【引证文献】
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【参考文献】
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【同被引文献】
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6 杨新河;苦丁茶皂苷类的提取纯化与检测技术研究[D];湖南农业大学;2005年
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8 刘磊;海蜇胶原蛋白的提取、纯化及理化性质研究[D];江南大学;2009年
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