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《浙江大学》 2006年
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转THPO和FL膜外区基因骨髓间充质干细胞对脐血造血干/祖细胞的体外扩增研究

解纯刚  
【摘要】:造血干细胞(HSCs)是指那些具有自我更新能力并能分化为所有血系细胞的干细胞。造血干细胞移植(HSCT)常被用来治疗血液系统疾病和作为血液系统恶性疾病高剂量化疗后的支持治疗。骨髓、外周血和脐带血是人类的主要造血干细胞源。由于脐带血中含有比骨髓和外周血更高比例的原始造血干细胞,目前认为脐带血是比骨髓和细胞因子动员的外周血更有前途的造血干细胞源。同时研究发现接受脐带血移植的病人的移植物抗宿主病(GVHD)的频率明显减小。单份脐带血中的造血干细胞对于重建儿童和体重较轻的成人的造血系统是足够的,但是,对于体重较大的成年人是不够的。为了解决这个问题,必须对脐带血造血干细胞进行体外扩增。本研究利用基因工程技术发展了一种独特的转双基因骨髓间充质干细胞,并利用该转基因骨髓间充质干细胞联合细胞因子对脐带血造血干细胞进行体外扩增。 骨髓间充质干细胞(MSCs)是来源于中胚层的具有很强的自我更新和多向分化能力的干细胞。本研究成功地分离纯化了骨髓间充质干细胞,并研究了骨髓间充质干细胞的体外生长特性。这些骨髓间充质干细胞在表型上呈典型的梭形纤维状,原代培养时间大约为14d。生长动力学分析表明,骨髓间充质干细胞呈典型的“S”型生长曲线。传代培养后细胞增殖能力增强,P_2—P_(20)代之间每代持续时间大约为6d:但P_(20)—P_(30)代之间细胞活力下降,每代持续时间大约为9d。在200d的培养期内,群体倍增时间在30—59h之间。在1—125d的培养期内,群体倍增时间缓慢维持在30—40h之间;在125—200d的培养期内,群体倍增时间急速从40h上升到59h。81.5%的骨髓间充质干细胞处于G_0/G_1期,呈典型的干细胞特性。流式细胞术分析表明,骨髓间充质干细胞表面抗原CD166、CD29和CD44为阳性,CD45、CD34和HLA-DR为阴性。 血小板生成素(THPO)和Flt-3配体(FL)是两个重要的早期造血刺激因子。本研究利用RT-PCR技术成功地从含有高丰度THPO和FL mRNA的胎肝细胞中克隆了THPO和FL膜外区基因。序列分析表明,THPO基因除了在蛋白信号肽序列中有一个碱基与Genebank中序列不同外,其他序列一致;FL膜外区序列与Genebank中序列完全一致。为了将THPO和FL膜外区基因导入骨髓间充质干细胞,我们利用内部核糖体进入位点序列(IRES)构建了双顺反子共表达逆转录病毒载体pLXPFIT。利用前刺激+离心沉淀+多轮转染的转染方法将逆转录病毒载体pLXPFIT导入骨髓间充质干细胞。RT-PCR和western blotting分析表明,转基因骨髓间充质干细胞中THPO和FL膜外区mRNA和蛋白表达水平明显高于原代骨髓间充质干细胞。酶联免疫吸附实验(ELISA)分析证明在8代的转基因骨髓间充质干细胞培
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:Q813.1

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