收藏本站
《浙江大学》 2007年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

嗜热脂肪地芽孢杆菌脂肪酶基因的克隆、表达及酶学性质研究

武鸿  
【摘要】: 脂肪酶(三脂酰甘油酰基水解酶,EC 3.1.1.3)广泛存在于动植物和微生物中,可催化三脂酰甘油的酯键水解,也可催化酯化、酯交换、醇解、酸解等反应,在洗涤剂工业、食品加工、皮革造纸等方面具有广泛应用。近年来,来自嗜温和嗜热微生物的热稳定脂肪酶的基本性质和工业应用倍受关注,其中主要来源之一是2001年新命名的嗜热脂肪地芽孢杆菌。但由于野生菌产脂肪酶能力低,主要研究方向集中于采用基因工程方法构建重组菌,通过表达来获得相应的脂肪酶。本课题亦采用此方法,在大肠杆菌中克隆并表达嗜热脂肪地芽孢杆菌脂肪酶基因。 本文首先在由胰蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏、NaCl组成的培养基中65℃条件下培养野生型嗜热脂肪地芽孢杆菌,收集菌体后采用合适的方法提取野生菌基因组作为PCR扩增模板,Pfu酶作DNA聚合酶,扩增得到约1.3kb条带,与pMD18-T Simple Vector连接进行TA克隆测序,验证目的基因得到正确扩增。 表达载体pET28c(+)及TA阳性克隆用BamHⅠ、NdeⅠ双酶切后,经T4 DNA连接酶连接构建得到碱基数为6590bp的重组质粒pET28c(+)-lipase,在DH5α中得到高效扩增。 克隆成功后,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)中表达,经SDS电泳与脂肪酶活性测定验证脂肪酶得到有效表达。对重组菌表达条件进行优化,培养至OD_(600)在1.0左右,加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L,28℃诱导6小时,以橄榄油为底物,脂肪酶酶活达到1.88U/mg。 最后对重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28c(+)-lipase所表达的脂肪酶的一些性质和影响酶活的因素进行了初步考察:在pH8.5的Tris-盐酸缓冲液(0.05mol/L)中,55℃条件下酶活最高,55℃时半衰期约8小时,10mM的Zn~(2+)、Fe~(2+)对酶的抑制显著,10mM的PMSF与粗酶液混合30分钟后酶活几乎完全被抑制。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q78

知网文化
【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 王迪;发酵性丝孢酵母脂肪酶与蛋白酶发酵及性质的比较[D];大连工业大学;2012年
2 谯娜娜;人葡萄球菌GIMT1.079脂肪酶基因的克隆与表达[D];天津科技大学;2010年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 林容霞;马延和;谭天伟;;低温脂肪酶产生菌的筛选及鉴定[J];北京化工大学学报(自然科学版);2006年01期
2 王智,苟小军,曹淑桂;脂肪酶在生物化工中的应用[J];成都大学学报(自然科学版);2003年01期
3 孙宏丹,孟秀香,贾莉,宋振岚;微生物脂肪酶及其相关研究进展[J];大连医科大学学报;2001年04期
4 张小霞,严卫星,徐海滨;外源蛋白质表达系统类型的研究进展[J];国外医学(卫生学分册);2004年04期
5 单志文,王鲁,周晓云;脂肪酶基因表达、调控及其作用机制的研究进展[J];国外医学.遗传学分册;2001年03期
6 胡学智;国内外酶制剂工业及其应用[J];工业微生物;2001年03期
7 郑毅;叶海梅;周虓;吴朝娟;吴松刚;;脂肪酶活力测定研究进展[J];工业微生物;2005年04期
8 黄锡荣,张文娟,宋少芳,李越中,曲音波;分光光度法测定微乳液中脂肪酶的酶活[J];化学通报;2001年10期
9 杨永梅,韩望,魏武,洪芳,刘成君;碱性脂肪酶产生菌的筛选与产酶条件及酶学性质研究[J];四川大学学报(自然科学版);2003年05期
10 魏决,付忠旭,于志强,肖青;特异性脂肪酶产生菌筛选及平板筛选模型的建立[J];四川食品与发酵;2005年02期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 晋青波;张庆庆;汤斌;危勤涛;;紫外诱变原生质体提高脂肪酶活力[J];安徽工程科技学院学报(自然科学版);2008年01期
2 张云峰;;嗜热蛋白酶生产菌DPE7的16 S rRNA基因克隆及系统发育[J];安徽农业科学;2008年22期
3 张煜星;武寒雪;祝建波;刘焕;周鹏;;铜绿假单胞菌脂肪酶Lipase基因的原核表达[J];安徽农业科学;2008年35期
4 尹瑞卿;丁玉;陈明达;鞠明里;黄姗姗;;黄芩苷对胰脂肪酶的抑制机理研究[J];安徽农业科学;2009年24期
5 王刚;吕熹;李俊;郭明珠;王波;陈光;;有机溶剂耐受性脂肪酶的研究进展[J];安徽农业科学;2010年02期
6 王自社;张继;马君义;史睿;;脂肪酶的研究及应用进展[J];安徽农业科学;2011年07期
7 薛静;陶树兴;田泽英;苏蕊;丛寅;;脂肪酶产生菌的筛选·产酶条件及酶特性研究[J];安徽农业科学;2011年15期
8 李军红;姜绍通;童洋洋;;产脂肪酶真菌的筛选及产酶条件优化[J];安徽农业科学;2011年26期
9 陈凤;王坤;银超;李德明;任楠;李俊星;;根癌农杆菌介导的泡盛曲霉遗传转化系统的构建[J];安徽农业科学;2012年16期
10 黄琼林;何瑞;詹若挺;陈蔚文;;青天葵EBP1基因原核表达载体的构建[J];安徽农业科学;2012年16期
中国重要会议论文全文数据库 前2条
1 余清;;酶工程在食品工业中的应用研究及其未来展望[A];福建省农业工程学会2006年学术年会论文集[C];2006年
2 沈芳;刘雄民;梁静娟;李飘英;梁文波;;ω-羟基烷酸甲酯的脂肪酶催化合成环十五内酯的研究[A];第九届全国化学工艺学术年会论文集[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 苑博华;伯克霍尔德菌的筛选、鉴定及其发酵产低温脂肪酶的研究[D];江南大学;2010年
2 宋建民;乳酸片球菌素的表达纯化与高密度发酵研究[D];华东理工大学;2011年
3 王刚;耐有机溶剂脂肪酶高活性菌株选育、酶合成及酶学特性研究[D];吉林农业大学;2011年
4 钱云开;纤维堆囊菌胞内脂类内含物成分、形成及其对埃博霉素生物合成的影响[D];山东大学;2010年
5 沈芳;两种体系中的15-羟基十五烷酸甲酯酶催化合成环十五内酯及动力学研究[D];广西大学;2011年
6 林琳;扩展青霉PF898碱性脂肪酶基因的克隆与表达[D];福建农林大学;2001年
7 王柏婧;古细菌Aeropyrum pernix K1嗜热酶的催化活性和稳定性研究[D];吉林大学;2004年
8 杨秀霞;南极细菌Moritella sp.低温脂肪酶基因的克隆与表达[D];中国海洋大学;2004年
9 郑元平;地衣芽孢杆菌ZJU0107热稳定性β-葡聚糖酶的酶学特性及其在啤酒生产中的应用[D];浙江大学;2004年
10 丁彦蕊;嗜热菌耐热性与蛋白质序列、结构和功能关系的生物信息学研究[D];江南大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王树云;斑点叉尾鮰病毒ORF6和ORF10基因的原核表达及其功能的初步研究[D];华中农业大学;2010年
2 龚文芳;棉花抗细胞凋亡基因GhDAD1的克隆、定位及表达分析[D];华中农业大学;2010年
3 刘辉;红曲霉发酵提高γ-氨基丁酸含量的研究[D];安徽工程大学;2010年
4 谷桂娜;介孔分子筛的合成及其孔道中脂肪酶固定化的研究[D];辽宁师范大学;2010年
5 丁玲;面粉生物增白剂的研究与应用[D];安徽农业大学;2010年
6 郭晓红;嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶的基因克隆、表达及性质研究[D];山东农业大学;2010年
7 罗帅;棉籽油生物柴油制备的试验研究[D];昆明理工大学;2009年
8 罗伟;一株假单胞菌低温脂肪酶基因的克隆及表达[D];昆明理工大学;2009年
9 林瑞凤;扩展青霉脂肪酶“盖子”结构域突变对其活性影响的研究[D];福建师范大学;2010年
10 赵娜;表面活性剂对饲用油乳化效果及肉鸡生长的影响[D];浙江工商大学;2011年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 于明安,朱晓冰,祁巍,赵领,魏郁梦;CTAB透性化酵母细胞生物催化合成(S)-(+)-3-羟基丁酸乙酯[J];催化学报;2005年07期
2 周秀琴;;微生物脂肪酶的生产及应用[J];发酵科技通讯;2009年03期
3 姚咏嫦;;插入式超声对酵母细胞膜通透性影响的研究[J];广东化工;2006年01期
4 孔繁林;储从家;管新龙;李杰芬;;345株临床分离的凝固酶阴性葡萄球菌耐药性分析[J];中国感染控制杂志;2008年02期
5 张小霞,严卫星,徐海滨;外源蛋白质表达系统类型的研究进展[J];国外医学(卫生学分册);2004年04期
6 里伟;杜伟;刘德华;胥青;;固定化R.oryzae细胞发酵产胞内脂肪酶及其催化制备生物柴油[J];高校化学工程学报;2008年05期
7 颜兴和,王栋,徐岩;根霉脂肪酶的研究进展[J];工业微生物;2005年03期
8 郑毅;叶海梅;周虓;吴朝娟;吴松刚;;脂肪酶活力测定研究进展[J];工业微生物;2005年04期
9 舒正玉;王爱玲;杨江科;闫云君;;提高微生物脂肪酶产量、活性和稳定性的方法研究[J];工业微生物;2007年03期
10 蒲丽丽,刘宁,张英华,霍贵成;乳酸菌冻干保护剂及保护机理的研究进展[J];现代食品科技;2005年01期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 唐良华;脂肪酶的生产及其在布洛芬手性拆分中的应用基础研究[D];浙江大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前7条
1 吴吟妮;扩展青霉FS1884碱性脂肪酶的表征研究及其晶体的培养[D];福建师范大学;2005年
2 高新亮;脂肪酶固定化及其催化性能研究[D];大连理工大学;2006年
3 穆文侠;真菌脂肪酶的液态发酵、固定化及其应用[D];安徽农业大学;2007年
4 何文礼;有机溶剂中脂肪酶催化制备生物柴油的研究[D];湖南农业大学;2007年
5 郭道义;洋葱假单胞菌G63脂肪酶产酶条件优化及同源高效表达[D];华中科技大学;2006年
6 邓静;几种小分子物质对胰蛋白酶部分性质的影响研究[D];四川大学;2007年
7 陈天祥;菊粉酶的固态发酵及其保护剂的研究[D];江南大学;2009年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 孙宏丹,孟秀香,贾莉,宋振岚;微生物脂肪酶及其相关研究进展[J];大连医科大学学报;2001年04期
2 孙国华,孙楠,肖晓光,朱鸿;单底物一步速率法测定血清脂肪酶及其临床应用[J];大连医科大学学报;2003年01期
3 王江雁;血清脂肪酶的测定方法及临床诊断评价[J];国外医学.临床生物化学与检验学分册;1995年01期
4 黄建忠,施巧琴,郑毅,吴松刚;中温碱性脂肪酶的研究 Ⅰ.高产菌株——扩展青霉PF868的选育[J];工业微生物;1995年03期
5 黄锡荣,张文娟,宋少芳,李越中,曲音波;分光光度法测定微乳液中脂肪酶的酶活[J];化学通报;2001年10期
6 冯俊,卓仁禧,贺枫;聚(碳酸酯-co-磷酸酯)的酶促合成及性能[J];中国科学(B辑 化学);2002年06期
7 邬敏辰;脂肪酶基因结构和氨基酸序列的比较[J];江南学院学报;2001年02期
8 孙艳;血清脂肪酶测定研究进展[J];江西医学检验;2002年06期
9 曹淑桂;脂肪酶的底物特异性及其应用潜力[J];生物化学与生物物理进展;1995年01期
10 尹顺义,宗敏华,刘耘,姚汝华;有机相中脂肪酶催化棕榈油酯交换反应生产代可可酯的研究[J];食品与发酵工业;1995年02期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 彭仁;林金萍;魏东芝;;耐有机溶剂脂肪酶产生菌的筛选和鉴定[J];江西师范大学学报(自然科学版);2011年02期
2 张敏;黎继烈;蒋丽娟;王卫;袁强;;脂肪酶产生菌的紫外诱变选育[J];河南科技学院学报;2009年04期
3 刘维英;韩亚杰;胡坤;代斌;;合成己酸乙酯脂肪酶产生菌的筛选及发酵条件的研究[J];生物技术通报;2009年03期
4 苏敏;唐良华;夏黎明;郑丹华;;Aspergillus sp.脂肪酶发酵条件优化及酶学性质的研究[J];生物技术;2005年06期
5 苗新宇;滕利荣;袁立佳;王贞佐;孟庆繁;高波;;提取脂肪酶的一种新方法——纳米机破碎法[J];吉林大学学报(理学版);2006年03期
6 谭珍连;梁静娟;庞宗文;覃晓娟;;原生质体紫外诱变选育白地霉GXU08脂肪酶高产菌株[J];生物技术;2007年02期
7 晋青波;张庆庆;汤斌;危勤涛;;紫外诱变原生质体提高脂肪酶活力[J];安徽工程科技学院学报(自然科学版);2008年01期
8 张庆庆;晋青波;危勤涛;;原生质体紫外诱变脂肪酶高产菌株[J];食品工业科技;2008年04期
9 杨建军;马晓迅;王贵军;;大孔树脂吸附固定化脂肪酶机理研究[J];西北大学学报(自然科学版);2009年02期
10 王静云;武秋娟;包永明;李小明;;产脂肪酶嗜碱细菌的筛选及酶学性质研究[J];生物技术;2010年06期
中国重要会议论文全文数据库 前7条
1 闫丽娟;贺胜英;唐湘华;李俊俊;黄遵锡;;黑曲霉NJY-1脂肪酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达[A];饲用酶制剂开发与应用技术交流研讨会论文集[C];2010年
2 郭建林;马恒甲;王友慧;叶金云;陈建明;潘茜;沈斌乾;;水温对瓯江彩鲤消化酶的影响[A];2010年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
3 翁少萍;章之蓉;黄晖;谢瑞生;何家林;;超声处理水、磁场处理水和激光处理水对过氧化氢酶、脂肪酶及胰蛋白酶活力的影响[A];首届粤港生物物理学术研讨会论文集[C];1999年
4 高顺宾;吴天星;;L-肉碱对生长肥育猪消化酶活力的影响[A];第四届全国饲料营养学术研讨会论文集[C];2002年
5 刘宁;赵谋明;汪勇;付敏;;磷脂酶Lecitase~ Ultra的固定化、结构表征及性质研究[A];管产学研助推食品安全重庆高峰论坛——2011年中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程分会学术年会暨全国食品科学与工程博士生学术论坛论文集[C];2011年
6 谭崇桂;冷向军;李小勤;粟雄高;刘波;柴仙琦;;饲料中添加艾佐迈对南美白对虾生长性能及抗病力的影响[A];渔业科技创新与发展方式转变——2011年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
7 林岗;饶小珍;陈宁;郭世群;许友勤;;龟足成体的五种消化酶活力[A];中国甲壳动物学会第十一届年会暨学术研讨会论文摘要集[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 彭仁;耐有机溶剂脂肪酶的筛选、重组表达及其催化特性研究[D];华东理工大学;2010年
2 陈美龄;全细胞脂肪酶生物催化剂的构建及其在生物转化中的应用[D];浙江大学;2012年
3 于珊珊;重组嗜热闪烁杆菌脂肪酶系的性质表征及嗜热磷酸三酯酶晶体结构解析[D];吉林大学;2010年
4 刘文山;脂肪酶在酿酒酵母中的表面展示研究[D];华中科技大学;2010年
5 苑博华;伯克霍尔德菌的筛选、鉴定及其发酵产低温脂肪酶的研究[D];江南大学;2010年
6 杨光;脂肪酶固定化的新方法研究及其应用[D];浙江大学;2009年
7 高楠;褶皱假丝酵母脂肪酶热稳定性改造的设计与抗氧化酶的人工模拟[D];吉林大学;2011年
8 孙宇飞;真菌疏水蛋白表面展示对毕赤酵母细胞疏水性及共展示南极假丝酵母脂肪酶B的影响[D];华南理工大学;2013年
9 徐同成;1,3-甘油二酯对2型糖尿病的影响及选择性水解甘油三酯sn-2位酯键酶基因的克隆与表达[D];浙江大学;2008年
10 薛继鹏;三聚氰胺、氧化鱼油和脂肪对瓦氏黄颡鱼生长和体色的影响[D];中国海洋大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王迪;发酵性丝孢酵母脂肪酶与蛋白酶发酵及性质的比较[D];大连工业大学;2012年
2 张瑜;超高压对脂肪酶活性的影响及其机制初探[D];江南大学;2012年
3 邓颖颖;黑曲霉脂肪酶的摇瓶发酵、性质及其合成月桂酸单酯的研究[D];江南大学;2012年
4 陈大伟;洋葱假单胞菌脂肪酶在非水相介质中构效关系的研究[D];华中科技大学;2012年
5 董恒涛;粗状假丝酵母脂肪酶的分离纯化水解乳脂的研究[D];华南理工大学;2010年
6 王金主;高产脂肪酶菌株的选育研究[D];济南大学;2011年
7 田野;假丝酵母99-125生产脂肪酶的发酵工艺研究[D];内蒙古农业大学;2011年
8 王颖;热稳定性脂肪酶生产菌的筛选、性质及其应用研究[D];兰州理工大学;2014年
9 周晶;一株脂肪酶产生菌的筛选鉴定、发酵条件优化及其酶学性质研究[D];中国计量学院;2012年
10 王世辉;微胶囊法固定脂肪酶及拆分手性胺的研究[D];吉林大学;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026