蒽环类抗肿瘤药物致髓系白血病细胞耐药机制及应对策略的基础和临床研究

【摘要】： 第一部分阿霉素对K562细胞的作用特点及机制的研究 目的：通过观察阿霉素对K562细胞的作用特点，试图从细胞周期，细胞凋亡，hTERT基因表达及端粒酶活性，MDR1基因及Pgp蛋白表达等方面了解其耐药机制，以期为进一步克服耐药寻找有效的方法和途径。方法：流式细胞仪检测细胞周期，PgP蛋白表达及细胞凋亡；TRAP-ELISA法检测端粒酶活性；实时荧光定量RT-PCR检测MDR1基因及hTERT基因的表达。结果：实验首先对0.01mg/L，0.03mg/L，0.05mg/L，0.1mg/L四种浓度及24小时，36小时，48小时，60小时，72小时及4.5天阿霉素对K562细胞增殖的特点进行了观察。所有浓度的阿霉素在作用的第36小时K562细胞的存活率均一过性的升高，第36小时后随着阿霉素剂量的逐渐增加及作用时间的逐渐延长，K562细胞的存活率逐渐下降。在第36小时，阿霉素对K562细胞的G2/M期表现出阻滞作用，随着阿霉素剂量的升高G2/M期阻滞程度越来越高。不同浓度的阿霉素作用下K562细胞的凋亡率第36小时均为0％，第24小时时，随着阿霉素浓度的增加，细胞凋亡率越来越低。0.01mg/L阿霉素作用于K562细胞在第36小时时端粒酶活性出现一过性的升高，在第36小时以前和以后均表现为端粒酶活性的降低；在第36小时以前，0.03mg/L，0.05mg/L，0.1mg/L阿霉素作用的K562细胞端粒酶活性都表现为降低，从第36小时开始都升高。不同浓度阿霉素对K562细胞hTERT基因表达的影响没有差别。0.05mg/L阿霉素作用于K562细胞的第4.5天，细胞的存活率达到最低。继续进行细胞培养，第9天细胞存活率开始升高。第31天，细胞的存活率超过80％。第12小时，细胞MDR1基因表达开始升高，第40天时超过14000倍。第32天Pgp蛋白表达开始增加，第38天Pgp的表达达到K562/A02细胞的水平。结论：阿霉素可阻滞K562细胞于G2/M期，抑制K562细胞的凋亡，上调K562细胞的端粒酶活性。阿霉素可诱发K562细胞的MDR1基因和Pgp蛋白表达增加，但不同步。 第二部分高三尖杉酯碱联合阿霉素对K562细胞的作用特点及机制的研究 目的：通过观察高三尖杉酯碱与阿霉素联合作用下K562细胞在细胞周期，细胞凋亡及端粒酶活性等方面变化的特点，来进一步明确阿霉素对K562细胞的作用机制；同时也通过观察两药联合作用于K562细胞时的作用特点，为临床两药的联合应用提供实验依据。方法：流式细胞仪检测细胞周期，Pgp蛋白及细胞凋亡；TRAP-ELISA法检测端粒酶活性；实时荧光定量RT-PCR检测MDR1基因。结果：10μg/l的高三尖杉酯碱及10μg/l的高三尖杉酯碱分别与0.01mg/l，0.03mg/l，0.05mg/l阿霉素联合作用于K562细胞，在作用的第36小时K562细胞的存活率均一过性的升高。第36小时后K562细胞均表现出剂量和时间依赖性的增殖抑制作用。10μg/l高三尖杉酯碱对K562细胞的增殖抑制作用介于0.01mg/l和0.03mg/l阿霉素的作用之间。0.05mg/l的阿霉素联合10μg/l的高三尖杉酯碱作用于K562细胞，对细胞的作用相当于0.1mg/l的阿霉素。10μg/1的高三尖杉酯碱单独作用于K562细胞时，G2/M期细胞比例仅仅在第36小时时出现了4.79％的增加。第36小时，0.03mg/l和0.05mg/l阿霉素与10μg/l的高三尖杉酯碱联合作用于K562细胞时G2/M期细胞比例增加，但与0.03mg/l和0.05mg/l阿霉素单药对K562细胞周期的影响相比，联合用药时G2/M期细胞比例增加的幅度明显减小。10μg/1高三尖杉酯碱单独作用于K562细胞，细胞的凋亡率从第24小时的24.68％降为第36小时的0％，第60小时及第11天凋亡率又升高。10μg/l高三尖杉酯碱分别联合各个浓度的阿霉素作用于K562细胞时，第36小时细胞凋亡率均为0％，第24小时细胞凋亡率较阿霉素单药为高。10μg/l高三尖杉酯碱单药及联合阿霉素除第36小时外都下调K562细胞的端粒酶活性。联用高三尖杉酯碱使所有浓度的阿霉素作用的K562细胞端粒酶活性开始升高的时间从第24小时提前至第12小时。10μg/l高三尖杉酯碱作用于K562细胞首先表现为细胞增殖的抑制，在第5.5天达到抑制的最低点，第11天高三尖杉酯碱对细胞的抑制率降低为30％左右并维持这一水平。第86小时开始出现MDR1基因表达的增加，第48天达到120倍左右，第19天Pgp蛋白表达开始增加，第48天时Pgp蛋白接近30％。结论：高三尖杉酯碱可部分抑制阿霉素对K562细胞的G2/M期阻滞，减轻阿霉素引起的凋亡抑制，但对第36小时细胞的零凋亡率没有影响，可下调阿霉素引起升高的端粒酶活性。高三尖杉酯碱也可诱发K562细胞MDR1基因和Pgp蛋白表达增加，也不同步。 第三部分高三尖杉酯碱联合阿克拉霉素及阿糖胞苷对初发成人急性體系白血病临床疗效 目的：观察HAA方案治疗初发急性髓系白血病的疗效及毒副作用。方法：诱导缓解方案由高三尖杉酯碱，阿克拉霉素和阿糖胞苷三药联合组成，简称HAA方案。高三尖杉酯碱4mg/m~2/天，每天分两次每次2mg/m~2肌肉注射或静脉滴注4小时每天1次，共3天(第1天至第3天)；阿克拉霉素12mg/m~2/天，静脉滴注2小时，每天一次，共7天(第1天至第7天)；阿糖胞苷150mg/m~2/天，每天分两次每次75mg/m~2皮下注射，共7天(第1天至第7天)。在病人获得完全缓解后的第2-4周给予同样剂量的HAA方案一个疗程作为巩固治疗。维持治疗时间为3年。总存活率(OS)和无复发存活率(RFS)采用Kaplan-Meier方法。结果：诱导缓解的第一个疗程HAA方案完全缓解率为79％(38/48)，部分缓解率为6％(3/48)，未缓解率为10％(5/48)。HAA方案的完全缓解率83％(40/48)。M5病人完全缓解率72％，非M5病人完全缓解率90％。细胞遗传学预后良好的11例病人完全缓解率为100％，细胞遗传学预后中等的病人完全缓解率为82％，细胞遗传学预后不良的病人完全缓解率33％。从治疗开始到完全缓解的时间是32天。诱导缓解阶段化疗所引起的最常见的副作用是感染。90％病人表现出不同程度的感染，33％病人为严重感染。脑出血病人4％。诱导缓解阶段所有的病人均出现粒细胞缺乏和严重的血小板减少。中性粒细胞低于1×10~9/l的持续时间为12天。从化疗 开始到血小板数恢复正常(100×10~9/l)的时间为24天。3年OS为53％，3年RFS为52％。M5病人的3年总存活率和3年无复发存活率均为75％，而非M5病人3年总存活率为44％，3年无复发存活率为40％。具有预后良好和预后中等细胞遗传学特征病人的3年总存活率分别为61％和52％；具有预后不良细胞遗传学特征病人的3年总存活时间为5.5个月。结论：HAA方案治疗初发急性髓系白血病有较好的临床疗效，毒副作用可以接受。

【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R733.7