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《浙江大学》 2007年
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从分子及细胞水平的改变研究经口摄入的Cr(Ⅵ)对小鼠的毒性效应

王晓峰  
【摘要】: 铬是自然界中广泛存在的一种元素,主要以三价铬(Cr(Ⅲ))和六价铬(Cr(Ⅵ))的形式存在。受环境中物理、化学和生物等因素的影响,Cr(Ⅲ)与Cr(Ⅵ)之间可以相互转化,但两者对人类健康有着截然不同的影响。Cr(Ⅲ)是一种人体必需的微量元素,它是葡萄糖耐量因子的组成部分,对调节糖代谢、维持体内正常的耐量起重要作用。而Cr(Ⅵ)则被列为对人体危害最大的化学物质之一,也是国际公认的重金属致癌物。 随着铬化合物在工业上的广泛使用,这些生产工业排放的废水、废气和废渣造成的铬污染问题已受到全世界的普遍关注。散布在环境中的Cr(Ⅵ)以离子状态随水循环,它不能被微生物分解,但可被动植物吸收向人体转移,并沿食物链出现生物放大效应,进而影响整个生态系统的平衡,危害人类健康。Cr(Ⅵ)可通过皮肤接触、呼吸吸入和经口摄入三种方式进入人体。其中,皮肤接触和呼吸吸入是职业人群接触Cr(Ⅵ)的主要途径。研究证实,长期暴露于Cr(Ⅵ)环境中的作业工人易患过敏性皮炎和湿疹,还能出现鼻粘膜穿孔或溃疡,慢性鼻炎和支气管炎,甚至导致肺气肿,从而影响肺功能。呼吸吸入的Cr(Ⅵ)对人体造成的最严重的危害在于增加了罹患呼吸道肿瘤的危险性。经口摄入包括饮水和摄入食物,是非职业人群接触Cr(Ⅵ)的最主要方式,国内外学者先后报道了多起因食入Cr(Ⅵ)污染的食物影响人群健康的事件。 大量体外实验证实Cr(Ⅵ)对多种细胞均具有毒性效应,包括肝细胞、肾细胞、成纤维细胞以及淋巴细胞等。此外,皮下注射和腹腔内注射Cr(Ⅵ)的动物实验研究也证实Cr(Ⅵ)能引起机体多个脏器的损伤,其中以肝脏和肾脏的损伤较为明显。但是,由于Cr(Ⅵ)特殊的致毒机制,以皮下注射和腹腔内注射方式建立的动物模型实验并不能正确反映经口摄入的Cr(Ⅵ)对机体产生的毒性效应。而在为数不多的以灌胃或自由饮水方式摄入Cr(Ⅵ)的动物实验中,对Cr(Ⅵ)引起机体毒性效应的研究至今未有定论。 为进一步阐明经口摄入的Cr(Ⅵ)在体内的毒性效应,有必要从分子和细胞水平上研究其在体内可能的致毒机理。综合对Cr(Ⅵ)的一系列体外和体内的研究可以得出,Cr(Ⅵ)引起毒性的最为重要的一个方面就是大量活性活性氧(ROS)的生成并由此引起的氧化应激。近年来,大量研究表明,ROS与细胞凋亡存在着十分密切的关系,它可通过多个信号途径干扰正常的细胞凋亡。因此,通过研究Cr(Ⅵ)对细胞凋亡的诱导有可能阐明Cr(Ⅵ)在体内的致毒机理。 本研究对受试动物以灌胃方式给予Cr(Ⅵ),通过比较其对不同组织器官造成的损伤,进一步研究经口摄入的Cr(Ⅵ)在体内引起的毒性效应;同时,通过研究Cr(Ⅵ)对细胞凋亡的诱导,以凋亡重要相关蛋白的改变为研究中心探讨其在体内的毒作用机理。 按实验设计,将健康雄性ICR小鼠随机分为4组,每组均为10只;对照组用蒸馏水灌胃,处理组以K_2Cr_2O_7溶液灌胃,剂量设计分别为25、50、100mg/kg体重,灌胃量以小鼠体重计为0.1mL/10g体重。每天灌胃1次,分别给予灌胃1d或5d。染毒结束后继续饲养24h,处死前对小鼠进行摘眼球取血,并立即分离血淋巴细胞进行彗星实验。处死小鼠后迅速切取部分新鲜肝脏和肾脏组织,用于电镜实验和TUNEL实验;剩余组织用液氮速冻后用Western blot进行p53、Bcl-2、Bax、细胞色素c蛋白水平测定以及caspase-3酶活化水平测定,并进行ROS水平、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性的检测。 实验结果如下: 1.K_2Cr_2O_7染毒小鼠外周血淋巴细胞彗星实验结果显示,1d或5d染毒后随剂量的增加各染毒组尾长也随之升高,并具有显著性差异;除5d染毒的最低剂量组外,其余两个时间段的各染毒组尾相均显著高于对照组;但5d染毒与1d染毒的尾长及尾相数值相比,升高趋势有所降低。 2.K_2Cr_2O_7染毒1d或5d后小鼠肝脏ROS水平均高于对照组,并且,除1d染毒的最低剂量组外,其余各剂量组与对照组比均具有显著性差异。 3.小鼠经K_2Cr_2O_7染毒1d后最低剂量组肝脏SOD活性稍高于对照组,但并无显著性差异,其余两个剂量组SOD活性与对照组相比均无明显变化;5d染毒后各剂量组的SOD活性均显著低于对照组。 4.K_2Cr_2O_7染毒小鼠肝脏CAT活性除1d和5d染毒的最低剂量组与对照组无明显差异外其余各组均低于对照组且具有显著性差异。 5.小鼠经K_2Cr_2O_7染毒1d或5d后,随剂量的升高肝脏MDA含量有上升趋势,但与对照组相比未见统计学差异。 6.经K_2Cr_2O_7染毒1d或5d后,各剂量组小鼠肾脏ROS、MDA、SOD和CAT与对照组相比均没有显著性差异。 7.透射电镜显示,与对照相比,经K_2Cr_2O_7染毒1d或5d后小鼠肝脏细胞超微结构均出现凋亡特征性改变:细胞核皱缩,染色质浓缩并发生边聚化;线粒体变的致密,嵴消失,并且线粒体发生空泡化改变。 8.本研究用TUNEL实验检测K_2Cr_2O_7染毒后小鼠肝脏细胞DNA降解情况,结果所示:与对照组相比,K_2Cr_2O_7染毒1d后小鼠肝细胞核呈棕色的细胞即凋亡细胞数明显增多;5d染毒小鼠肝细胞内也发生相似改变。在1d和5d的两个染毒时间段,随剂量的升高调亡率也随之上升,并显著高于对照组,呈现出明显的剂量反应关系。 9.小鼠经0、25、50、100mg/kg K_2Cr_2O_7染毒1d或5d后,肝组织细胞内caspase-3酶原裂解产生的caspase-3活性片段(17kD)蛋白条带逐渐变粗。与对照组相比,随染毒剂量的增加,caspase-3酶活化逐渐增加,并在最高剂量组100mg/kg差异具有显著性。 10.小鼠染毒后肝组织细胞内p53蛋白水平情况显示,与对照组相比,1d或5d染毒的各剂量组小鼠肝组织细胞内p53蛋白水平均有升高,并在最高剂量组100mg/kg时差异具有显著性。 11.经K_2Cr_2O_7染毒1d或5d后小鼠肝组织细胞内Bcl-2蛋白水平随染毒剂量的增加均呈下降趋势,并且,1d染毒的100mg/kg以及5d染毒的50mg/kg和100mg/kg剂量组均显著低于对照组。Bax蛋白水平随染毒剂量的增加均有升高,但仅在5d染毒的100mg/kg剂量组蛋白水平显著高于对照组。 12.1d或5d染毒小鼠肝组织细胞胞浆内细胞色素c蛋白水平随染毒剂量的增加均呈升高趋势,并且,1d染毒的50mg/kg和100mg/kg剂量组以及5d染毒的100mg/kg剂量组均显著高于对照组。 主要结论: 1.Cr(Ⅵ)灌胃引起小鼠肝脏ROS的显著升高,同时抗氧化酶SOD和CAT活性也明显降低,表明经口摄入的Cr(Ⅵ)破坏体内抗氧化系统的平衡并使机体处于氧化应激状态是Cr(Ⅵ)引起毒性效应的一个重要原因。 2.与肝脏相比,本研究未发现Cr(Ⅵ)灌胃后小鼠肾脏出现明显的氧化应激,表明经口摄入的Cr(Ⅵ)经过体内氧化还原代谢后对机体各个组织器官造成的毒性效应会有较大差异。 3.Cr(Ⅵ)染毒后,小鼠淋巴细胞DNA出现损伤,表明经口摄入的Cr(Ⅵ)在体内产生的ROS和/或还原过程中产生的低价态Cr所引起的DNA损伤是Cr(Ⅵ)的毒性作用之一。 4.Cr(Ⅵ)染毒导致肝细胞发生凋亡,同时肝脏组织中凋亡相关蛋白p53、Bcl-2、Bax、细胞色素c蛋白水平以及caspase-3酶活化水平也发生明显改变,表明p53、Bcl-2、Bax、细胞色素c以及caspase-3参与了Cr(Ⅵ)诱导的细胞凋亡。该结果提示:Cr(Ⅵ)引起机体毒性效应的一个重要原因很有可能就是干扰了机体正常的细胞凋亡过程。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R114

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【引证文献】
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6 仲维莉;补脾益肠汤对溃疡性结肠炎模型小鼠氧自由基水平影响的实验研究[D];黑龙江中医药大学;2007年
7 李强;丁苯酞注射液对慢性脑低灌注大鼠自由基代谢及PARP蛋白表达的影响[D];河北医科大学;2009年
8 肖文霞;氧化应激与胎膜早破的相关性研究[D];河北医科大学;2006年
9 张露洁;Cd~(2+)、Hg~(2+)、Cr~(6+)胁迫对组培盾叶薯蓣生理指标的影响[D];四川大学;2006年
10 金玉;人参皂苷Rb1和红景天苷抗UVB照射永生化角质形成细胞氧化损伤能力的研究[D];南京中医药大学;2009年
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