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《浙江大学》 2007年
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乙型肝炎病毒在人类卵母细胞和早期胚胎内整合的研究

胡小玲  
【摘要】: 背景 乙型肝炎是危害人类健康的全球性疾病。全球有20多亿人有乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的感染史,其中约有3.5亿人为HBV的慢性携带者。目前,约有1/3的世界人口生活在HBV感染率较高的地区。HBV的感染与80%的原发性肝细胞癌具有相关性,每年约有100多万人死于因HBV感染引起的严重肝脏疾病,WHO已将HBV的感染列为世界第九大死亡原因。我国是乙型肝炎的高发区,乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)携带者达10%—15%,每年有50万—100万的新增病例。 目前,经过适当的主动、被动联合免疫,能够有效阻断多数HBV的感染,但免疫接种后仍然有10%~20%的婴儿阻断失败,阻断失败的原因不明。 HBV的传播途径有输血;体液接触(包括血清、唾液、阴道分泌物、乳汁和精液接触);宫内感染;细胞、组织和器官移植;血液透析工具和药物静脉注射等。此外,还有一种新的、尚待证实的传播方式,即垂直传播。 垂直传播:指患者的生殖细胞受病毒感染,在受精时由精子或卵细胞作为载体,将病毒基因带到胚胎进而使子代患病。按性别划分,垂直传播又分为父婴垂直传播和母婴垂直传播。 阻断失败是否与垂直传播相关?对于HBV垂直传播的研究可能有助于这一问题的回答。关于父婴垂直传播,国内外学者对此进行了相关研究,结果发现,精子内存在着HBV DNA的整合,并且主要存在于乙型肝炎患者精子头的膜部和核心部,精子被感染的机制涉及对HBV DNA的主动捕获,这些研究表明HBV可能通过精子细胞进行垂直传播。又有研究发现,在母方HBsAg阴性,父方精子HBV DNA阳性的引产胎儿全身多个器官如肝脏、小肠、肾、肺及肌肉组织内存在着完整的HBV DNA,并且父婴间HBV的序列同源性达到98%—100%。动物实验表明,将脂质体包裹的质粒直接注射到雄鼠体内,HBV DNA能够进入雄性生殖细胞,整合到宿主基因组内,并通过自然受精随精子进入卵母细胞,在早期胚胎中复制与表达,从而为乙肝患者可能通过受染精子向子代传播HBV建立了体内研究的实验模型,为HBV的父婴垂直传播途径提供了相关的科学证据。对于HBV母婴垂直传播的研究,由于卵母细胞不易获得,母婴传播过程复杂,受到多因素、多环节的影响,又缺乏理想的动物模型等因素的影响,该项研究很难进行。与此同时,长期以来,一些学者认为卵母细胞外的透明带可能阻止外源基因进入卵母细胞。在2006年,有一项研究首次发现在卵巢组织内不同发育阶段的卵母细胞核内存在HBcAg的表达,动物试验表明,HBV能整合进入小鼠卵母细胞内,并在小鼠的二细胞胚内存在复制与表达,这表明HBV母婴垂直传播存在可能。但是,上述相关人的卵母细胞的研究较少,可重复性也有待进一步研究证明,此外,目前研究多集中在动物实验方面,对于处于生物进化的最高层次的人类胚胎尚缺少相关研究,因此,本研究旨在利用生物素标记的含全长HBV DNA的pBR322—HBV DNA质粒探针进行荧光原位杂交(fluorescenece in Situ hybirdization,FISH)检测HBV DNA是否能整合进入生殖细胞,以及进入生殖细胞内的HBV DNA是否能顺利通过受精遗传至早期胚胎,从而为HBV的垂直传播提供直接证据。 材料与方法 选择2006年6月—2007年1月在浙江大学医学院附属妇产科医院就诊行辅助生育技术治疗并经ELISA检查的16例女方HBsAg阳性的35个未受精卵,22对女方HBsAg阳性夫妇的27个废弃胚胎、15对男方HBsAg阳性夫妇的26个废弃胚胎以及8对夫妇双方HBsAg均为阳性的21个废弃胚胎,共74个废弃胚胎为实验组;24对夫妇双方HBV两对半检测均为阴性的12个未受精卵和34个废弃胚胎为阴性对照组;Hepa 1175肝癌细胞为阳性对照组。以异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的pBR322-HBV DNA探针进行荧光原位杂交(fluorescenece in situ hybirdization,FISH)检测HBV DNA在卵母细胞和早期胚胎基因组内的整合,以DIG标记的HBX DNA探针对最后3次洗涤液进行斑点杂交排除HBV DNA阳性信号来自于卵泡液或细胞膜的可能。所有研究对象均无免疫缺陷综合症病史。标本的收集经医院伦理委员会讨论批准,并经患者知情同意。 结果 35个卵母细胞中1个卵母细胞染色体上检测到特异性的HBV DNA信号,阳性检出率为2.9%(1/35);74个胚胎中11个早期胚胎细胞的1-4个细胞核内(含双原核受精卵到桑椹胚不同发育阶段胚胎)检测到特异性的HBV DNA信号,胚胎细胞的阳性检出率为14.9%(11/74),两者间虽存在差异,但无统计学意义。卵母细胞和胚胎总的阳性率为11.0%(12/109)。女方HBsAg阳性、男方HBsAg阳性和夫妇双方HBsAg阳性的胚胎阳性检出率分别为14.8%(4/27)、11.5%(3/26)和19.0%(4/21),各组间阳性检出率无统计学差异,并在2个8细胞胚胎的同一个细胞核内均检测到2个HBV DNA信号。早期胚胎内检测到阳性信号的夫妇双方至少有一方为HBeAg和(或)同时存在preS1阳性的胚胎所占百分比为81.8%(9/11)。阴性对照卵母细胞和胚胎均未见特异性的HBV DNA信号;阳性对照的肝癌细胞内可见特异性的HBV DNA信号。最后3次洗涤液标本斑点杂交检测HBV DNA阴性,排除了FISH阳性结果来自细胞膜或卵泡液污染的可能。 结论 (1)卵母细胞基因组内存在HBV DNA的整合。 (2)人类生殖细胞携带的HBVDNA能够通过受精的方式垂直传递给早期胚胎。 (3) HBV DNA在基因组内存在单位点或多位点整合。 (4)本研究为HBV经生殖细胞的垂直传播提供了初步的实验证据,垂直传播发生的机制还需要进一步深入研究。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R714

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