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《浙江大学》 2006年
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人类胶质瘤肿瘤干细胞的检测和分离培养的研究

陈江利  
【摘要】: 近年的研究认为肿瘤是一种干细胞疾病,是由具有成瘤能力的肿瘤细胞增殖发育而成的异常组织。肿瘤细胞中仅有极少数的细胞具有成瘤潜能,它们数量虽少,但可无限增殖,并可以对称分裂进行自我更新或不对称分裂产生不具有成瘤能力的普通肿瘤细胞,因此具有干细胞特征,称之为肿瘤干细胞。肿瘤干细胞在肿瘤发生和进展过程中起到了决定性作用;而其他肿瘤细胞没有或仅有有限殖能力,经短暂的分化即死亡。 肿瘤干细胞首先在血液系统恶性肿瘤中被发现证实,随后的研究表明,实体瘤也包含肿瘤干细胞。实体肿瘤是由异质性的肿瘤细胞群组成的异常组织。传统观点认为是遗传的不稳定性和环境因素的影响造成了肿瘤细胞表型的多样性。肿瘤干细胞理论认为肿瘤是肿瘤干细胞增殖而成的异常组织,它在增殖过程中存在异常的分化现象,从而形成了异质性的肿瘤细胞群。目前认为肿瘤干细胞理论能更好地解释肿瘤中细胞的异质性。 Singh等从星型细胞瘤、室管膜细胞瘤、少枝细胞瘤等多个新鲜脑肿瘤标本中分离出CD133~+和CD133~-的脑瘤细胞,并把这些细胞移植到NOD/SCID小鼠的大脑中,100个CD133~+肿瘤细胞就可以引起小鼠中肿瘤的形成,而10~5个CD133~-的肿瘤细胞却不能形成肿瘤,通过一系列的免疫组织化学比较CD133~+形成的肿瘤的细胞表现型与原位肿瘤是一样的。表明脑肿瘤组织中CD133~+细胞代表了肿瘤干细胞。 脑肿瘤干细胞的另一个特性是不被核染料Hoechst33342所着色,因此在流式细胞术中呈现为侧细胞群(Side Population,SP),这一特性是因为脑肿瘤干细胞表达ABCG2,又称为乳腺癌抗药蛋白1(Breast cancer-resistant protein 1,BCRP1),属于ATP结合转运体(ATP-Binding Cassette,ABC)家族。因此,ABCG2也是脑肿瘤干细胞的特异性标记物。 为了明确人类胶质瘤中肿瘤干细胞的分布,本研究利用CD133和ABCG2两种Marker,检测临床不同病理级别、原发和复发胶质瘤标本中的肿瘤干细胞。并利用无血清培养法,从新鲜胶质瘤标本中分离、培养肿瘤干细胞。 材料与方法 1、伦理学本研究所使用的全部胶质瘤标本,均已在术前征得患者或家属的知情同意,并取得浙江大学医学院伦理学委员会批准。本研究过程和内容对患者无任何不利影响。 2、主要试剂 DMEM培养基、DMEM/F12培养基(GIBCO公司)。r-h EGF、r-h bFGF(Sigma公司),B27 serum-free supplement(50×)liquid(Gibco公司),谷氨酰胺(GIBCO公司),0.25%胰蛋白酶(Gibco公司),BSA、EDTA、DMSO(上海生工)。抗CD133 IgG、抗ABCG2 IgG(Santa Cruz公司)。生物素化二抗、SABC免疫组化试剂盒、枸橼酸盐抗原修复液、DAB免疫组化显色试剂盒(北京中山公司)。 3、肿瘤干细胞的检测——免疫组织化学染色 1)取新鲜胶质瘤组织,4%甲醛固定,常规方法制成石蜡切片,HE染色病理检查,同时给予针对CD133和ABCG2的免疫组化染色,以评价肿瘤干细胞在不同病理等级、原发或复发的胶质瘤中的分布状况。计数10个随机200×视野中阳性细胞数与总细胞数,阳性率=阳性细胞数/总细胞数。 4、肿瘤干细胞的分离、培养 1)肿瘤干细胞原代培养:脑胶质瘤标本(5×5×5mm~3)离体5分钟以内,移至一个含有DMEM培养基的无菌Eppendoff管中,4℃条件下5分钟内送到细胞实验室。严格无菌条件下,眼科剪剪成1mm~3小块,加入0.25%胰酶与0.02%EDTA(1:1)边消化边用滴管吹打约5分钟。以完全培养基中止消化。过300目尼龙筛网,离心,弃上清,台盼蓝拒染法计数活细胞。1000rmp×5min离心收集细胞沉淀,用无血清DMEM/F12培养基重悬细胞,调节细胞密度为(2—5)×10~5/ml,接种到Corning塑料培养瓶,加入2%B27、20ng/mlbFGF和20ng/mlEGF,放入37℃、5%CO~2培养箱中培养。倒置显微镜下观察细胞生长状态。每2-3天半量换液1次,每6—7天传代1次。 2)肿瘤干细胞传代培养:1000rpm离心8min收集细胞团,加入0.25%胰酶与0.02%EDTA(1:1)进行消化,并轻轻吹打成单细胞状态,用完全培养基中止消化。离心收集细胞,无血清培养基重悬,计数后接种到新培养瓶进行培养,并添加神经生长因子(同上)。培养基中每两周补加一次谷氨酰胺。 3)肿瘤干细胞冻存和复苏:收集需冻存的肿瘤干细胞至离心管,1000rpm离心5分钟后弃上清,按冻存细胞所需浓度(2×10~6细胞/ml),定量加入预冷的肿瘤干细胞冻存液(无血清培养基+10%DMSO+0.1%BSA)。混匀后,将细胞悬液转移到冻存管,每管1ml,封口作好标记。先在4℃30min,然后放入-20℃冻存2h,再转入-80℃过夜,次日保存于液氮中。复苏细胞时,将冻存管由液氮迅速转入到37℃水浴中,待细胞解冻后,将细胞转移到含有4℃预冷的肿瘤干细胞培养液的离心管中(按1:10的比例),1000rpm离心5分钟后弃上清,将细胞重悬于新鲜的培养液中。 4)体外培养肿瘤干细胞的鉴定:通过CD133免疫细胞化学染色进行鉴定,CD133(+)细胞为肿瘤干细胞。 5、统计学方法 全部数据用平均值±标准差((?)±s 5)表示,采用SPSS10.0软件进行统计分析。CD133和ABCG2阳性率的组间差异用X~2检验,P<0.05表示差异有显著性意义。 结果 1、临床特点 本研究包括胶质瘤患者共36例,全部病理学确诊。其中原发胶质瘤28例,复发胶质瘤8例。病理诊断:星形胶质细胞瘤21例,少枝胶质细胞瘤5例,星形-少枝胶质细胞瘤8例,胶质母细胞瘤2例。WHO分级:Ⅰ-Ⅱ级13例,Ⅲ-Ⅳ级23例。所有病例术前MRI均诊断为胶质瘤。 2、各种病理类型的胶质瘤都有肿瘤干细胞 本研究36例胶质瘤标本切片中,均存在CD133(+)和ABCG2(+)细胞,该结果支持肿瘤干细胞是各种类型胶质瘤的共同来源的观点。阳性细胞主要散在或呈“巢状”分布于大量阴性细胞之间;除了坏死和囊变区,在瘤体的中央和周边部位均有分布。根据同一样本相邻两张切片的免疫组化染色结果,CD133(+)细胞和ABCG2(+)细胞基本重叠,表明了CD133和ABCG2在肿瘤干细胞中共表达,都是人类胶质瘤肿瘤干细胞的特异性标记物。 3、胶质瘤分化程度与肿瘤干细胞的数量无关 高分化胶质瘤(Ⅰ-Ⅱ级)和低分化胶质瘤(Ⅲ-Ⅳ级)标本中的肿瘤干细胞数量(0.37%vs 0.38%)无显著性差异。事实上,临床上可以普遍观察到,低分化胶质瘤(包括胶质母细胞瘤)的增殖速度明显超过高分化胶质瘤;但是,肿瘤干细胞比例并不高于高分化肿瘤。根据文献资料,肿瘤干细胞本身处于相对静息的状态,偶尔通过对称分裂进行自我更新,或通过不对称分裂产生普通肿瘤细胞;普通肿瘤细胞具有旺盛的分裂能力,是肿瘤增长的主要方式。因此我们认为,高分化胶质瘤和低分化胶质瘤增殖的差异不在于干细胞数量的区别,而是由于肿瘤细胞分裂速度的不同。 4、复发胶质瘤的肿瘤干细胞比例高于原发胶质瘤 复发胶质瘤的肿瘤于细胞比例略高于原发胶质瘤(0.35%vs 0.46%),差异具有统计学意义。ABCG2是重要的肿瘤耐药基因,可以将化疗药物、细胞因子或某些诱导分化的小分子物质泵出细胞外,保护肿瘤干细胞免于分化或凋亡;此外,肿瘤干细胞多处于G_0期,对放化疗不敏感;因此肿瘤干细胞在选择性生存压力下(如肿瘤免疫、化疗、放疗)明显具有优势。我们推测,复发胶质瘤在临床干预以及复发的过程中,将有更多的肿瘤干细胞被选择并保存下来。 5、肿瘤干细胞培养成功 2例新鲜胶质瘤标本制备成单细胞悬液,在含有丝分裂原的无血清培养基中培养,培养5天内大量细胞死亡,被换液清除;存活细胞逐渐增殖形成悬浮的细胞团,称为肿瘤球“Tumorosphere”。虽然培养基和培养条件完全一致,但来源于星形-少枝胶质细胞瘤(WHOⅡ级)的肿瘤球扩增速度明显低于来源于胶质母细胞瘤的肿瘤球。 传代和冻存时,肿瘤球被消化成单细胞悬液,传代后,肿瘤干细胞可以在2-3天内重新聚集成肿瘤球,反复传代6次,肿瘤球的形态保持一致,表明肿瘤干细胞具有自我更新能力。肿瘤干细胞冻存1月,复苏后仍可以快速增殖,并形成肿瘤球。 肿瘤球爬片进行免疫细胞化学染色,发现约46.6%细胞为CD133阳性细胞,证明通过无血清培养法有效扩增了肿瘤干细胞。 结论 1、各种病理类型的胶质瘤都有肿瘤干细胞; 2、胶质瘤分化程度与肿瘤干细胞的数量无关; 3、复发胶质瘤中肿瘤干细胞比例更高; 4、通过无血清悬浮培养法,可成功扩增人类脑肿瘤干细胞。
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