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《浙江大学》 2007年
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耐辐射球菌中两个抗氧化蛋白功能及类胡萝卜素制备方法研究

吴媛媛  
【摘要】: 耐辐射球菌是地球上最抗辐射的生物之一,其超强的极端环境抗性机制,一直是各国研究者的追踪热点。目前的研究认为,耐辐射球菌的抗性机制可归为保护、耐受和修复三个方面。在半个多世纪的研究中,科学家们也试图寻找耐辐射球菌独特的机制,来理解该细菌超强的辐射抗性。随着近几年自由基生物学的迅猛发展,研究者认为耐辐射球菌的抗氧化机制是其具有超强电离辐射抗性的主要原因之一,并开展了相关的研究工作。耐辐射球菌体内已有许多抗氧化酶类、抗氧化蛋白、非酶类物质被相继报道了,还不断有新的成员被发现。我们认为,开展关于耐辐射球菌抗氧化机制的研究,不仅有助于我们更好地理解其独特的逆境抗性,也将对人类疾病的防止与治疗有一定的贡献。本论文研究,以耐辐射球菌的氧化抗性机制为主线,完成了以下三部分的研究工作。 解螺旋酶RecG在生物体中担任了重要的损伤修复功能,在假单孢菌中发现该蛋白与氧化抗性相关。我们通过基因敲除突变的方法,成功获得耐辐射球菌解螺旋酶RecG功能缺陷的突变株。系列表型实验结果显示,drrecG基因的缺失引起菌株辐射抗性和氧化抗性的急剧下降,主要是引起菌株细胞提取物清除活性氧自由基的能力大大下降。同时,drrecG基因缺失的突变株MG中过氧化氢酶活性明显下降,主要以KatB的活性下降最为显著。脉冲场实验结果证实,在氧化胁迫条件下,drrecG的功能缺陷引起菌株基因组的不稳定性。以上结果说明:drrecG参与了耐辐射球菌的抗辐射损伤和抗氧化的过程;在耐辐射球菌的抗氧化过程中,drrecG对维持基因组稳定性和维持过氧化氢酶活性水平具有重要贡献。我们也研究了突变株MG的基因组转录情况,发现drrecG基因缺失引起参与能量代谢过程中的成员基因异常上调,核糖体蛋白基因被大量的抑制。我们认为drrecG的缺陷,可能导致了耐辐射球菌内部能量代谢的紊乱,这也是突变株MG在指数生长期出现明显的生长迟滞现象的原因之一。在低浓度的过氧化氢胁迫条件下,drrecG基因的缺失激起了大量损伤修复蛋白、损伤识别蛋白、抗氧化蛋白的基因上调,表明突变株MG经历了极其严峻的生存考验。上述结果再次证明drrecG基因是一个参与氧化抗性及损伤修复的重要因子。 dr1127基因的发现,源于我们实验室开展的耐辐射球菌基因组芯片工作和蛋白质组双向电泳研究。在野生株R1经过2,000Gy辐照处理后,dr1127基因及其产物表现出显著的上调状态。该基因的生物信息分析显示,dr1127基因可能与一些毒性离子的抗性有关。我们通过敲除dr1127基因的突变株,研究该基因在耐辐射球菌体内的生物学功能。dr1127基因缺陷株的逆境存活率结果显示,该基因的敲除引起菌株抵抗辐射损伤和氧化损伤的能力显著下降,表现为过氧化氢极度敏感。进一步的研究发现,以上现象的发生主要由于dr1127基因的缺失引起菌体细胞清除活性氧自由基的能力下降。菌体抗氧化酶活性测定结果显示,dr1127基因突变株中过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性较野生株的分别下降了302.23%和20.18%。以上结果显示,dr1127基因是耐辐射球菌体内维持辐射抗性和氧化抗性的重要基因,其在抗氧化过程中的作用可能部分来自其对抗氧化酶活性的调控。同时,我们在大肠杆菌表达系统中表达并纯化得到46KD的DR1127蛋白产物。在Fe~(2+)和H_2O_2组成的氧化损伤系统中,DR1127蛋白的加入可以有效地防止氧化损伤引起的DNA链缺口断裂以及片段断裂的情况。同时,我们在实验中观察到一个有趣的现象:随着DR1127蛋白添加量的增加,DNA在泳道中出现逐渐明显的拖带现象。蛋白质-DNA结合活性实验结果显示,DR1127蛋白可以结合双链DNA,随着蛋白量的增加,DR1127蛋白可以实现完全绑定DNA的功能。以上结果很好地解释了DR1127蛋白可能的生物学功能,在体外DR1127蛋白能够与DNA结合形成致密的蛋白质-DNA复合物,通过这种方式可以有效防止自由基直接攻击DNA分子,减少DNA损伤情况。 作为维生素A的前体,类胡萝卜素本身具有抗氧化以及其他多种生物学功能。随着类胡萝卜生理、药理功能认识的深入和在临床医学、食品工业及化妆品工业等方面的应用与研究,促进了类胡萝卜素的市场发展和工业化生产。目前已有很多微生物被用作发酵制取类胡萝卜素的研究报道,而耐辐射球菌作为一种原核微生物,具有生长周期短(30h左右,霉菌需要72-96h)、菌体破碎较容易、提取方法简便、便于发酵控制等特点,这在很大程度上满足了大规模生产类胡萝卜素的要求。通过研究,我们找到了以豆饼粉作为基础培养基并适当的补充碳源(蔗糖)和氮源(硝酸盐)取代了价格较高的的TGY(蛋白胨-葡萄糖-酵母膏)培养基,取得了很好的效果,而且从成本角度考虑更为节约生产成本。同时,我们也进行了培养条件的优化,正交实验的结果说明,在我们的实验范围内,在(葡萄糖3g/L,硝酸钠1.5g/L,pH=6.0)下,类胡萝卜素产量可达2.318 mg/g干重,为最优培养基配方。在各种有机溶剂中,提取产量由高到低依次为甲醇>(甲醇+丙酮,体积比1:1)>丙酮>正丁醇。我们的研究为利用耐辐射球菌发酵制取类胡萝卜素提供了可行性依据,实验室小试结果也为在发酵罐水平上生产类胡萝卜素提供了实验依据。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q936

【参考文献】
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