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《浙江大学》 2006年
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植物雌激素大豆黄酮对鸡胚卵巢和成鸡卵泡发育调控机理的研究

刘红云  
【摘要】: 本研究建立了鸡胚卵巢生殖细胞-体细胞共培养模型,研究了人参皂甙、促性腺激素和性激素对生殖细胞增殖的调控及其机理和异黄酮植物雌激素-大豆黄酮对鸡胚卵巢生殖细胞增殖的促进作用,并在细胞水平对其作用机理进行了深入探讨。同时,以伊莎鸡和丝羽乌骨鸡为研究对象,在体内从整体、分子等不同水平探讨了大豆黄酮对鸡产蛋性能的影响及其卵泡发育调节机制,其结果为大豆黄酮在蛋鸡生产上的应用及提高禽类特别是地方品种禽类的生产性能提供了科学的理论依据。 1.鸡胚卵巢生殖细胞-体细胞共培养模型的建立及其验证和应用 探索鸡胚卵巢生殖细胞分离培养的简易方法及条件,为深入研究内源性激素和异黄酮类植物雌激素对卵巢生殖细胞发育的影响及其机制提供实验模型。采用机械分散加胶原酶分解法分离18胚龄鸡胚卵巢细胞,体外共培养生殖细胞和体细胞,并用c-kit单克隆抗体进行生殖细胞的鉴定。结果表明添加10μg/mL胰岛素、5μg/mL转铁蛋白和3×10~(-8) mol/L亚硒酸钠的培养液(称ITS培养液)能较好地维持生殖细胞的存活和增殖。此外,采用c-kit免疫细胞化学方法对生殖细胞进行了特异性鉴定,结果显示卵巢生殖细胞呈c-kit染色阳性,而体细胞呈c-kit染色阴性。同时利用该模型研究了人参皂甙(GS)对鸡胚卵巢生殖细胞增殖的影响及其信号转导机制。结果显示GS(0.1~10μg/mL)可明显提高生殖细胞的数目(P<0.05),蛋白激酶C(PKC)激活剂Phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA,10~(-8)~10~(-6) M)可增强这种促进作用,而PKC抑制剂H_7(10~(-7)~10~(-5) M)则减弱了这种促进作用,并都呈现一定的剂量-效应关系。细胞增殖核抗原-标记指数(PCNA-LI)统计结果显示出与生殖细胞数目变化相似的趋势。以上结果表明GS能够促进鸡胚卵巢生殖细胞增殖,PKC信号途径可能参与了GS对卵巢生殖细胞的发育调节。同时实验进一步证实生殖细胞-体细胞共培养模型可以作为评价激素、激素样作用的外源性物质对卵巢生殖细胞体外增殖调节的实验模型。 2.FSH对鸡胚卵巢生殖细胞增殖的影响及其信号转导机制的研究 利用生殖细胞-体细胞共培养模型研究了FSH对鸡胚卵巢生殖细胞增殖的影响及其信号转导机制。18胚龄鸡胚卵巢细胞在培养的同时用FSH和腺苷酸环化酶(AC)的激活剂Forskolin(FRSK)、PKA抑制剂H_(89)、PKC激活剂PMA、PKC抑制剂H_7单独或联合处理。细胞培养48h后,计数生殖细胞数目并用PCNA标记增殖细胞,统计生殖细胞的PCNA-LI。结果显示FSH(10~1000ng/mL)可明显提高生殖细胞的数目(P<0.05),FRSK(10~(-7)~10~(-5) M)和PMA(10~(-8)~10~(-6)M)可增强这种促进作用,而H_(89)(10~(-7)~10~(-5) M)和H_7(10~(-7)~10~(-5) M)则分别减弱了FSH的促进作用。并都呈现出剂量-效应关系。PCNA-LI统计结果显示出与生殖细胞数目变化相似的趋势。以上结果表明FSH能够促进鸡胚卵巢生殖细胞增殖,PKA和PKC信号途径可能都参与了FSH对卵巢生殖细胞发育的调节。 3.雄激素对培养鸡胚卵巢生殖细胞增殖的影响及其作用机理的研究 实验利用已建立的生殖细胞-体细胞共培养模型研究了雄激素对鸡胚卵巢生殖细胞增殖的影响及其作用机理。卵巢细胞培养同时用睾酮(testosterone,T)和雄激素受体阻断剂Flutamide(FLU)、雌激素受体阻断剂Tamoxifen(TAM)、芳香化酶抑制剂Letrozole(LET)单独或联合处理。细胞培养48h后,计数生殖细胞数目并用PCNA标记增殖细胞,统计生殖细胞PCNA-LI。结果发现T(10~(-8)~10~(-6)M)明显提高了生殖细胞的数目(P<0.05),这种促进作用可被FLU(10~1000ng/mL)、TAM(10~1000ng/mL)、LET(10~(-9)~10~(-7)M)所阻断,并呈现一定的剂量-效应关系,PCNA-LI进一步证实了上述结论。以上结果表明,生殖细胞-体细胞共培养模型可以作为评价激素对卵巢生殖细胞体外增殖调节的实验模型。T可以通过雄激素样和雌激素样两种作用方式促进鸡胚卵巢生殖细胞的增殖。 4.大豆黄酮对鸡胚卵巢生殖细胞增殖的影响及其作用机理的研究 利用生殖细胞-体细胞共培养模型研究了植物雌激素大豆黄酮(DAI)对鸡胚卵巢生殖细胞增殖作用的雌激素样作用和抗氧化作用。卵巢细胞培养的同时用DAI和雌激素受体阻断剂TAM单独或联合处理。处理48h后,计数生殖细胞的数目并用PCNA标记增殖细胞,统计生殖细胞的PCNA-LI。结果发现DAI可显著提高生殖细胞的数目(P<0.05),且这种促进作用可被TAM所阻断。同时,生殖细胞PCNA-LI与生殖细胞数目变化呈现相似的趋势。为了进一步研究DAI的抗氧化作用,卵巢细胞被暴露于次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶活性氧产生系统。通过测定超氧化物歧化酶活力及谷胱甘肽水平的变化对系统抗氧化性能进行了评价。处在活性氧产生系统中的卵巢细胞受到严重损伤,这种损伤可被DAI,DAI+TAM明显缓解(P<0.05)。这些结果表明DAI可通过雌激素样作用促进卵巢生殖细胞增殖,同时可以通过抗氧化特性缓解活性氧引起的细胞毒性作用。 5.大豆黄酮对伊莎鸡和丝羽乌骨鸡产蛋性能和卵泡发育相关基因表达的影响 探讨了DAI对伊莎鸡和丝羽乌骨鸡产蛋性能及不同发育阶段卵泡中相关基因,包括促性腺激素受体(FSHR、LHR)、芳香化酶(P450arom)和催乳素受体(PRLR)mRNA表达的影响。分别随机选取16只产蛋后期伊莎鸡或丝羽乌骨鸡,等分为大豆黄酮组和对照组。对照组饲喂基础日粮,实验组在基础日粮中添加10mg/kg DAI,逐日记录产蛋个数、产蛋重,实验持续7周。实验结束后每组随机采集20枚蛋,分离蛋白和蛋黄,并称重;取出小黄卵泡和大白卵泡,分离排卵前卵泡(F1,F2,F3……)的颗粒层,通过相对定量RT-PCR法检测FSHR、LHR、P450arom和PRLR mRNA表达的相对丰度,同时比较DAI对丝羽乌骨鸡和伊莎鸡的影响强度。结果显示,FSHR、LHR、P450arom、PRLR在伊莎鸡/丝羽乌骨鸡不同发育阶段卵泡中的表达存在差异,DAI明显提高了产蛋晚期伊莎鸡/丝羽乌骨鸡的产蛋率及小黄卵泡、大白卵泡的数量,显著降低了丝羽乌骨鸡卵泡闭锁率,平均蛋重及排卵前卵泡数目也都存在增多趋势;部分卵泡FSHR、LHR、P450arom和PRLR四种基因mRNA表达的相对丰度显著增加,丝羽乌骨鸡对DAI表现出比伊莎鸡更高的敏感性。以上结果表明,在产蛋后期伊莎鸡/丝羽乌骨鸡基础日粮中添加DAI能够显著提高产蛋性能和不同发育阶段卵泡数目,降低卵泡闭锁率,并且上调部分卵泡中相关基因的表达以促进卵泡发育。 综上所述,本研究建立了鸡胚卵巢生殖细胞-体细胞共培养模型,发现c-kit可以对生殖细胞进行特异性鉴定。通过人参皂甙、促性腺激素和性激素对生殖细胞增殖的调控及其机理研究,对该模型进行了有效评价。实验证实GS能够促进鸡胚卵巢生殖细胞增殖,PKC信号途径可能参与GS对卵巢生殖细胞的发育调节;FSH能够促进鸡胚卵巢生殖细胞增殖,PKA和PKC信号途径都可能参与了其对卵巢生殖细胞的发育调节;T可以通过雄激素样和雌激素样两种作用方式促进鸡胚卵巢生殖细胞的增殖。DAI可通过雌激素样作用显著促进卵巢生殖细胞的增殖,且可以通过抗氧化特性缓解活性氧引起的细胞毒性作用;同时,DAI明显提高了产蛋晚期伊莎鸡和丝羽乌骨鸡的产蛋性能及不同发育阶段卵泡数量,显著降低了丝羽乌骨鸡卵泡闭锁率;显著上调了部分卵泡FSHR、LHR、P450arom和PRLR四种基因mRNA的表达水平。这些结果为大豆黄酮在蛋鸡生产上的应用及提高禽类特别是地方品种禽类的生产性能提供了科学的理论依据。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:S831

【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
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中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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9 王珏;李升和;程光亮;孙俊杰;欧定华;柳卫国;;蜂花粉对蛋鸡生产性能及甲状腺激素的影响[J];安徽科技学院学报;2007年02期
10 顾有方;张金平;陈会良;李升和;刘德义;李文超;;大豆黄酮对草杂鸡消化系统发育的影响[J];安徽科技学院学报;2010年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
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2 刘春龙;李忠秋;;大豆黄酮和染料木素对体外培养条件下奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响[A];中国奶业协会年会论文集2009(上册)[C];2009年
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4 隋美霞;刘大森;杨山亭;任燕锋;刘海霞;;改善牛奶品质的新型饲料添加剂——大豆异黄酮[A];首届中国奶业大会论文集(上册)[C];2010年
5 唐现文;张响英;;大豆黄酮对产蛋后期番鸭生产性能及血清激素水平的影响[A];2009山东饲料科学技术交流大会论文集[C];2009年
6 李宏建;刘逢芹;刘田云;李贵海;;药用植物野葛的根及其藤茎中大豆苷元的含量比较[A];第十二届山东省药剂学术会议论文集[C];2006年
7 艾晓杰;吴晓林;朱勇琪;吴忠贤;董德宽;韩正康;;大豆黄酮对奶牛乳成分的影响[A];2005年上海市动物学会学术会议论文集[C];2005年
8 孔庆友;;芦丁对奶牛产奶量与血清生化指标的影响[A];畜牧业环境、生态、安全生产与管理——2010年家畜环境与生态学术研讨会论文集[C];2010年
9 蒋守群;蒋宗勇;林映才;郑春田;;饲料营养对母猪泌乳力的影响[A];猪营养与饲料研究进展——第四届全国猪营养学术研讨会论文集[C];2003年
10 程忠刚;林映才;周桂莲;余德谦;蒋守群;蒋宗勇;;大豆黄酮对断奶仔猪生产性能、血清免疫指标和激素水平的影响[A];猪营养与饲料研究进展——第四届全国猪营养学术研讨会论文集[C];2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 康丽;鸡卵泡发育相关基因和miRNA的鉴定及功能分析[D];山东农业大学;2009年
2 闫振贵;不同途径免疫NDV弱毒苗诱导鸡体黏膜和系统免疫反应的研究[D];山东农业大学;2011年
3 郭旭东;芦丁对奶牛泌乳性能、瘤胃消化代谢和对大鼠乳腺发育的影响[D];中国农业科学院;2011年
4 张淑敏;Sul-F对心肌损伤的保护作用及其机制研究[D];中国海洋大学;2011年
5 王定发;玉米赤霉烯酮联合大豆异黄酮对青年母猪生殖器官发育、肝脏损伤和组织玉米赤霉烯酮残留的影响及其机制研究[D];华中农业大学;2011年
6 周炜;亚麻籽木脂素对动物消化代谢和生长的影响及机制探讨[D];南京农业大学;2008年
7 陆扬;大豆苷元对断奶和食物过敏动物消化道的影响及TLRs在感染进程中的表达[D];南京农业大学;2009年
8 姚浪群;安普霉素对仔猪蛋白质营养、内分泌和低温应激影响的研究[D];中国农业科学院;2000年
9 尹靖东;类黄酮对鸡蛋胆固醇及其氧化物形成的影响[D];中国农业科学院;2000年
10 傅启高;绍兴鸭优良产蛋性能的内分泌及分子生物学机制研究[D];南京农业大学;2000年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 黄潘;鸡胚性分化早期性别差异表达miRNAs的鉴定及其特性分析[D];华中农业大学;2010年
2 肖培新;代用花粉对蜂群群势和生产性能的影响及蜜蜂抗氧化酶基因表达的研究[D];山东农业大学;2010年
3 曹桂云;白车轴草中化学成分的研究[D];山东中医药大学;2010年
4 刘宗敏;金柑总黄酮生理活性研究[D];中南林业科技大学;2006年
5 刘明杰;姜粉对肉牛营养物质消化吸收和机体抗氧化能力影响的研究[D];山东农业大学;2011年
6 金甲正;三江白猪GH、IGF-Ⅰ基因多态性及与早期生长性能的关联分析[D];黑龙江八一农垦大学;2011年
7 牛付阁;大高良姜黄酮的提取、分离纯化及抗氧化作用研究[D];陕西师范大学;2011年
8 周萍芳;苜蓿黄酮提取物对麻鸡生产性能及脂肪沉积的影响[D];江西农业大学;2011年
9 黄光中;葡萄籽等植物提取物与人工水草在黄鳝养殖上的应用[D];湖南农业大学;2011年
10 冯欣璐;药物诱导性反转鸡、鹌鹑及其属间杂交种胚胎性别相关基因表达规律的研究[D];石河子大学;2010年
【同被引文献】
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1 冯雪;周惠芳;;卵泡发育不良综合征的研究进展[J];长春中医药大学学报;2009年02期
2 靳峰涛;王安;胡晨晖;;低温环境下维生素E水平对初产蛋鸭性激素分泌和抗氧化指标的影响[J];动物营养学报;2011年10期
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4 胡顺勇;左秀峰;;蛋鸡不能维持产蛋高峰的常见原因及改善措施[J];山东畜牧兽医;2010年09期
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10 刘越;吕社民;;单核苷酸多态性影响基因功能的机制[J];生命的化学;2008年02期
中国重要会议论文全文数据库 前2条
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2 江新生;徐妙珍;黄康;杜炳旺;;文昌鸡繁殖性能分子水平的研究与肉品质的研究进展[A];第二届中国黄羽肉鸡行业发展大会会刊[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前4条
1 康丽;鸡卵泡发育相关基因和miRNA的鉴定及功能分析[D];山东农业大学;2009年
2 贾玉东;前列腺素和槲皮素对鸡等级前卵泡发育的调节作用及机理的研究[D];浙江大学;2011年
3 林金杏;局部性促生长因子对鸡卵泡发育的调控及其机理的研究[D];浙江大学;2011年
4 金艳梅;鸡等级前卵泡颗粒细胞发育的激素和营养调控及机理研究[D];浙江大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前5条
1 吴婷;Slit/Robo信号对原肠胚血管发生的作用研究[D];广东药学院;2010年
2 杨桓;鸡产蛋相关基因多态性检测及其与蛋用性状的关联分析[D];华中农业大学;2011年
3 李彩萍;生殖激素对体外培养的水牛卵泡颗粒细胞凋亡的影响研究[D];广西大学;2006年
4 詹慧琴;鸡产蛋相关基因的SNPs检测及其与蛋用性能关系的研究[D];华中农业大学;2006年
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【二级引证文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 常玲玲;顾欢;童海兵;邹剑敏;施寿荣;;大豆黄酮在蛋鸡饲粮中的安全性评价:体内沉积[J];动物营养学报;2013年11期
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中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【相似文献】
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3 洪文杰;倪迎冬;杨晓静;任灵芝;赵茹茜;;孵化早期蛋内注射大豆黄酮对仔鸡生长与血液指标的影响[A];全国动物生理生化第十次学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
4 艾晓杰;吴晓林;朱勇琪;吴忠贤;董德宽;韩正康;;大豆黄酮对荷斯坦牛围产期血液生化成分的影响[A];动物生理生化学分会第八次学术会议暨全国反刍动物营养生理生化第三次学术研讨会论文摘要汇编[C];2004年
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7 张柳平;周豆豆;梁晓璇;刘佳利;崔胜;;大豆黄酮和牛磺酸在小鼠睾丸间质细胞中的作用和相关机理研究[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年
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9 杨晓静;赵茹茜;朱祖康;陈杰;;不同来源大豆黄酮对肉用鹌鹑生产性能及有关免疫指标的影响[A];动物生理生化学分会第八次学术会议暨全国反刍动物营养生理生化第三次学术研讨会论文摘要汇编[C];2004年
10 刘春龙;李忠秋;张帆;姜文博;单安山;;大豆黄酮和染料木素对奶牛瘤胃内主要酶活性的影响[A];中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十次学术研讨会论文集[C];2008年
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1 余斌 郭荣富 张素华;大豆黄酮的生理功能及饲料添加剂的应用[N];中国畜牧兽医报;2008年
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1 于卓腾;大豆黄酮对仔猪肠道微生物的影响和雌马酚产生菌的分离及其特性的研究[D];南京农业大学;2007年
2 周玉传;大豆黄酮对绍鸭产蛋性能的影响及其作用的受体机制[D];南京农业大学;2003年
3 刘红云;植物雌激素大豆黄酮对鸡胚卵巢和成鸡卵泡发育调控机理的研究[D];浙江大学;2006年
4 尹靖东;类黄酮对鸡蛋胆固醇及其氧化物形成的影响[D];中国农业科学院;2000年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 任灵芝;蛋内注射大豆黄酮对肉仔鸡生长及相关基因表达的影响[D];南京农业大学;2008年
2 马学会;大豆黄酮对产蛋鸡作用研究[D];河北农业大学;2003年
3 刘兆斌;大豆黄酮对大鼠肌肉生长、内分泌水平与细胞免疫功能的影响[D];南京农业大学;2003年
4 洪文杰;大豆黄酮对鸡肝脏卵黄蛋白原基因表达的影响及机制研究[D];南京农业大学;2007年
5 王贵升;大豆黄酮的酶联免疫吸附分析方法的建立及其在大鼠血液、鸡蛋与饲料中含量的检测[D];南京农业大学;2002年
6 韩兆玉;大豆黄酮和7-异丙氧基异黄酮对雄性小白鼠精子品质睾丸生长及睾酮水平的影响[D];南京农业大学;2000年
7 王亚菊;母源性大豆黄酮对雏鸭生长及其相关基因表达的影响[D];南京农业大学;2002年
8 朱河水;大豆黄酮对奶牛泌乳和几种激素水平的影响[D];河南农业大学;2001年
9 杨建英;大豆黄酮对不同泌乳期奶牛产奶量、乳成分的影响及相关作用机制的研究[D];河南农业大学;2003年
10 顾欢;大豆黄酮对59-70周龄蛋鸡产蛋性能的影响及安全性评价[D];扬州大学;2013年
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