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《浙江大学》 2007年
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角蛋白酶生产菌株选育、发酵与分离纯化研究

蔡成岗  
【摘要】: 本文分离到了一株产角蛋白酶的枯草芽孢杆菌,诱变育种得到了具有良好羽毛降解能力和较高产酶活力的菌株KD-N_2;分别以羽毛和人发为底物对KD-N_2的产酶培养基、培养条件、发酵动力学进行了研究,探讨了以羽毛为底物发酵所得角蛋白酶的分离纯化、酶学性质,研究了角蛋白的降解过程及机理,最后对角蛋白酶脱毛效果进行了实验。主要研究结果如下: (1)从养殖场采集的样品中分离到一株具有羽毛降解能力的菌株,经形态学、生理生化和分子特征鉴定为枯草芽孢杆菌。通过亚硝基胍诱变得到一株酶活性提高1.5倍的突变株KD-N_2,该突变株最适生长温度和pH值分别为28℃和6.6,其发酵所得粗酶液的最适作用温度为50℃,pH值为8.0。确定了以可溶性角蛋白和天青角蛋白作为底物的酶活性测定方法。 (2)比较了羽毛、蚕丝、羊毛、人发等底物诱导产角蛋白酶的效果,发酵24h时最佳底物为10g/L羽毛。初始pH值7.5-8.0,培养温度23℃,接种量为2%-5%,种龄16h时有利于产酶。正交实验确定了以羽毛为唯一底物时的培养基组成(g/L):羽毛10,NaCl 0.5,MgSO_4 0.2,KH_2PO_4/K_2HPO_4 0.35/0.7,培养24h后酶活为66.5 U/mL。培养30h时角蛋白酶活性和可溶性蛋白含量达最大值,发酵液中含苏氨酸,缬氨酸,蛋氨酸,异亮氨酸,苯丙氨酸和赖氨酸等必需氨基酸,半胱氨酸含量最高为0.154 mg/mL,氨含量为0.4424 mg/mL。进一步优化实验结果表明,最佳产酶有机氮源牛肉膏浓度为0.5 g/L,有机碳源玉米粉为2 g/L,经响应面实验方法优化后培养基组成为(g/L):NaCl 0.5,MgSO_4 0.2,KH_2PO_4,/K_2HPO_4 0.35/0.7,CaCl_2 0.01,牛肉膏0.5,玉米粉2.0。碳、氮源的同时加入不利于诱导性角蛋白酶的较快产生。 (3)以人发为底物发酵产角蛋白酶实验结果表明:16 g/L人发浓度、初始pH值6.5、装液量20ml,接种量8%-10%时有利于产酶;在底物浓度10 g/L,接种量5%、培养温度28℃、转速200rpm时,最高产酶时间为36h;蔗糖、玉米粉、酵母提取物最佳产酶浓度均为10 g/L。部分因子实验表明MgSO_4和K_2HPO_4对产角蛋白酶具有显著影响,中心组合试验所得最佳发酵培养基组成为(g/L):MgSO_4 0.832,K_2HPO_4 2.38,NaCl 1.0,CaCl_2 0.05,KH_2PO_4 0.4,蔗糖3,优化培养基发酵后酶活性为124.8 U/ml,较原培养基提高了83%。 (4)以5L发酵罐探讨了以羽毛和人发为底物发酵产角蛋白酶的动力学。结果表明,以两底物发酵过程中,发酵液pH值、可溶性氨基酸和蛋白质含量均呈现增加趋势。其中,以羽毛为底物的发酵过程中氨基酸的生成可以用Peal-Reed模型进行描述:dp/dt=3.5479/1+6.5259e~((3.4823x2-0.42916x-0.00105x3)以羽毛为底物的菌体生长和产物生成动力学模型分别为:dx/dt=0.1013(1-x/0.3742)x和dp/dt=276.69 dx/dt3.6x 以人发为底物发酵过程中菌体生长和产物生成动力学模型分别为:dx/dt=0.0728(1-x/0.197)x和dp/dt=422.34 dx/dt+5.187x (5)以40%-80%饱和硫酸铵对角蛋白酶进行了回收,透析并浓缩后以凝胶层析和离子交换层析两方法对角蛋白酶进行了分离纯化,以SDS-PAGE和毛细管电泳的方法检验了角蛋白酶的纯度。该角蛋白酶分子量为30.5 kDa,最适作用pH值和温度分别为8.5和55℃,最适缓冲液为0.5mMTris-HCl;角蛋白酶活性被丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF部分抑制,EDTA在2.5mM、5mM和10mM三种浓度下均对角蛋白酶活性具有激活作用;金属离子Cu~(2+),Mn~(2+)完全抑制角蛋白酶的活性,Ca~(2+),Mg~(2+),Zn~(2+),Al~(3+)等离子和甲醇、乙醇、二甲基亚砜、异丙醇等有机溶剂部分抑制角蛋白酶的活性,去污剂SDS对角蛋白酶活性具有激活作用;角蛋白酶对可溶性蛋白质酪蛋白、牛血清蛋白和卵白蛋白具有水解作用,对不溶性蛋白质底物羽毛粉、人发和羊毛也具有一定的降解作用,对牛毛和蚕丝没有作用;还原剂二硫苏糖醇、巯基乙醇、亚硫酸钠和含硫化合物L-半胱氨酸、DMSO、氨基磺酸铵对角蛋白酶分解羽毛粉具有促进作用,以5mM DTT和5%的巯基乙醇对角蛋白酶激活作用最大,氨基磺酸铵对角蛋白酶的激活作用为首次报道。 (6)发酵过程中羽毛的降解率随羽毛含量增加而减小,在10 g/L羽毛含量时,初始pH值8.0-8.5,培养温度为32℃,接种量2%,种龄20h降解率较高。以羽毛、人发和蚕丝为底物发酵过程中,三种底物均有不同程度的降解,推测为发酵液对底物的溶胀作用、菌体生长、角蛋白酶酶解和机械振荡等共同作用的结果。 (7)对以羽毛和人发为底物发酵产角蛋白酶的脱毛效果进行了实验。结果表明,以两粗酶液对羊皮和小牛皮均有较好的脱毛效果。温度较高时脱毛效果更好。小牛皮更易被脱毛,用羽毛发酵所得的角蛋白酶液作用8-12h、以人发发酵所得的角蛋白酶液作用12-16h均可得到良好的脱毛效果。 以上研究为角蛋白酶的发酵生产和应用奠定了基础。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:TQ925

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