一个新的稻瘟菌致病相关基因MgLDB1的鉴定与功能分析

【摘要】： 稻瘟病(rice blast)是水稻上重要的病害之一,其病原菌为Magnaporthe grisea.了解M.grisea的致病分子机理不仅有利于稻瘟病的防治,而且作为研究植物病原真菌与寄主互作的理想模式系统,对于了解其它真菌的致病机理也有重要意义.T-DNA插入突变是鉴定致病相关基因的有效途径.本文通过农杆菌介导的稻瘟病菌转化发现一个致病相关基因MgLDB1,并用基因敲除和基因互补策略研究了MgLDB1基因在调控着稻瘟菌生长、分生孢子形成、有性生殖、致病性和细胞完整性等方面的重要作用.具体研究结果如下: 1致病性缺陷突变体A2-12-3获得经4次农杆菌介导的稻瘟菌转化获得3600个T-DNA插入转化子.经致病性测定鉴定出四个致病性丧失转化子A1-3-9、A1-17-9、GPD1-1和A2-12-3,其中A2-12-3转化子在CM和燕麦等培养基上没有分生孢子形成。 2 A2-12-3突变体及T-DNA标记基因鉴定经巢式反向PCR及其PCR产物克隆测序,外源T-DNA插入到稻瘟病菌假定蛋白基因MG01057.5的第四个外显子内,该基因有7个外显子,6个内含子,编码809个氨基酸.该基因编码的氨基酸序列与其它同源序列的相似性很低,且同源区集中在MgLDB1基因第400—第750氨基酸之间;结构预测表明这段氨基酸序列是LIM-domain bind结构域,在这个同源区有多个保守氨基酸,它们可能是LIM-domain binding蛋白的结构和功能基础.另外,在MgLDB1基因所编码的氨基酸序列中有KRRRPS...PRMQKR氨基酸区域,这个氨基酸序列与动物线虫、果蝇、小鼠和人类LDB基因的核定位序列从构成上具有很大的一致性,可能这些氨基酸是MgLDB1基因的核定位序列. 3 MgLDB1突变体表型分析一系列生物学性状研究表明,MgLDB1基因插入突变体A2-12-3和缺失突变体Amgldb1(AK58)生物学性状具有很大的一致性,它们与野生型Guy11性状有很大的差异:(1)突变体菌落形态呈暗绿色,常有水浸状斑出现,气生菌丝少,生长缓慢;(2)在不同的固体培养基上,没有分生孢子产生,也不能够完成有性生殖;(3)离体接种后,突变体对有、无伤口大麦都完全丧失致病性,对无伤口水稻也丧失了致病性,但是对有伤口水稻表现出轻微的致病性;(4)细胞完整性增强不同浓度SDS、calcofluor white、cango red和glucanex处理后,野生型Guy11在0.02%SDS浓度下不能够存活,而突变体A2-12-3和AK58在0.04%SDS依然可以生存;随着calcofluor white浓度增加,对突变体A2-12-3和AK58生长抑制较小,对野生型抑制作用较大;cango red对野生型和突变体菌落生长速度影响较小,且cango red对突变体和野生型抑制作用差异不明显;细胞壁降解酶Glucanex处理后突变体原生质体产量较低,说明基因突变体细胞完整性增强,对外界逆境具有更大的抗性;(6)不同浓度的NaC1处理后,突变体对渗透压敏感性变化不大.以上研究结果表明,MgLDB1调控着多个生物学性状. 4 MgLDB1时空表达以MgLDB1-GFP融合表达的恢复型转化子AC26为材料,经菌丝和分生孢子GFP与核染料DAPI荧光定位表明:MgLDB1蛋白定位于细胞核,这与LDB基因是核定位基因相符合.在该基因时序表达研究中,主要分析了菌丝、分生孢子及其分生孢子萌发形成附着孢过程中不同时间该基因的表达情况,结果表明该基因在稻瘟菌整个生命发育过程中不同发育阶段都有表达,调控着细胞发生、发展和分化,与LDB基因在整个生物发育过程中都参与调控相吻合. 5 MgLDB1突变体的表型互补pCB1532-MgLDB1-GFP融合表达载体(即MgLDB1基因互补载体)转化到MgLDB1基因缺失突变体A2-12-3原生质体后,获得10个有荧光表达的恢复转化子。恢复转化子的菌落形态、生长速度、分生孢子、产孢量、有性生殖、致病性等生物学性状与野生型Guy11性状有很大的一致性.MgLDB1基因引进A2-12-3突变体中恢复了野生表型性状,进一步证明该基因对这些性状的调控功能. 经过上述研究证明MgLDB1基因在调控着稻瘟菌生长、分生孢子形成、有性生殖、致病性和细胞完整性等方面具有重要的作用.