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苏云金杆菌营养期杀虫蛋白vip3基因及其在转基因水稻中的应用

方军  
【摘要】: 苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种广泛应用于农业害虫生防的细菌。许多Bt菌株在营养生长期分泌一种对鳞翅目昆虫有杀虫活性的蛋白质Vip3。研究表明Vip3与广泛使用的Bt晶体杀虫毒素在进化上没有同源性,并且在杀虫机理上也不相同。本论文描述了一种在Bt菌株中发现新型Vip3的方法,研究了不同Vip3及其嵌合蛋白(两种Vip3杂交获得的人工蛋白)的特性,并首次以抗Bt晶体杀虫毒素的害虫为对象研究了Vip3和Cry1Ac的交互抗性问题。进一步,我们设计了由一种晶体杀虫毒素和一种Vip3蛋白质融合的基因cry1Abvip3H,并将其转入水稻,获得了转基因抗虫水稻。 通过设计不同PCR引物,利用PCR的方法筛选了500个Bt分离株,获得了可能含有新vip3基因的Bt菌株。其中从一个Bt菌株克隆获得了vip3Ab2全基因,并在大肠杆菌中获得了表达。生物测定发现,Vip3Ab2对秋黏虫和美洲棉铃虫的杀虫活性很高,但对家蚕的杀虫活性很低。进一步,为了改良Vip3的杀虫能力,Vip3Ab2和另外一个Vip3蛋白质Vip3Aa1杂交获得2个嵌和蛋白Vip3AbAa(由Vip3Ab2的N-端1-600个氨基酸和Vip3Aa1的C-端601-789个氨基酸组成)和Vip3AaAb(由Vip3Aa1的N-端1-600个氨基酸和Vip3Ab2的C-端601-788个氨基酸组成)。生物测定发现,相对于Vip3Ab2和Vip3Aa1,Vip3haAb的杀虫活性大幅降低,而Vip3AbAa对秋黏虫、粉纹夜蛾和家蚕的活性均增加。特别是,Vip3Ab2和Vip3Aa1对欧洲玉米螟均没有杀虫活性,Vip3AbAa则表现出对欧洲玉米螟的杀虫活性。 比较了Vip3对敏感和抗Cry1Ac的粉纹夜蛾的杀虫活性差异。结果显示,Vip3Ab2、Vip3Aa1和Vip3AbAa对敏感和抗性昆虫都具有很高杀虫活性。这说明Vip3A和Cry1A这两种蛋白无交互抗性。因此,vip3A基因可以用来产生转基因抗虫作物来控制害虫抗性的发展。 根据单子叶植物的DNA密码偏好性人工合成vip3H和cry1Ab基因,并设计了一个cry1Abvip3H融合基因。在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的这种融合蛋白在使用胰蛋白酶降解后,利用Vip3的抗体对降解情况的进行免疫分析。结果发现,融合蛋白可以被降解为抗胰蛋白酶的62kDa的Vip3核心蛋白。生物测定表明,在E.coli中表达的Cry1AbVip3H对秋黏虫、棉铃虫、美洲棉铃虫、小地老虎和烟芽夜蛾均有杀虫活性。 利用玉米泛素启动子控制融合基因,通过农杆菌(Agrobacteriumtumefaciems)转导获得转基因水稻。Western Bolt检测结果显示,转基因水稻各个组织均可以表达Cry1AbVip3H,表达量从多到少依次为叶片、茎杆、根和种子。而且,转基因抗虫水稻在小规模田间试验时对稻纵卷叶螟抗虫效果良好。说明本研究获得的转基因水稻可以培育抗虫转基因水稻。


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