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BmNPV ORF9和ORF56基因功能分析

杨章女  
【摘要】: 杆状病毒已经在世界上广泛地应用于生物杀虫剂,并且作为载体在昆虫细胞以及虫体上表达了许多外源基因。最近,家蚕核型多角体病毒Bombyx morinucleopolyherovirus(BmNPV)已经成功地在表面展示系统上得到了应用。另外,杆状病毒也被认为在基因治疗上具有很大的潜在应用价值。这些应用使得杆状病毒感染的分子机理的研究方兴未艾。BmNPV的全基因组序列的测定,为单个基因功能研究的广泛开展提供了基础。 BmNPV ORF9(Bm9)是鳞翅目杆状病毒特有的基因,但其功能还不清楚。本文中我们对Bm9基因产物的功能开展了系统研究。在含有BmNPV bacmid的大肠杆菌E.coli中,得到了Bm9敲除的BmNPV bacmid病毒。Bm9基因敲除的bacmid感染细胞后,与野生型bacmid相比,BV产量大幅下降,然而病毒DNA的复制并没有受到影响。接着,将Bm9基因异位补回到多角体区域来拯救bacmid,BV产量得到恢复。电镜分析显示,多角体的形成并没有因为基因敲除而受到影响。用BV注射来进行的生物测定发现,敲除的病毒与野生型病毒相比,杀死幼虫时间延迟14-22个小时,而且其LD_(50)比野生型病毒高15倍,说明Bm9是一个和病毒感染力相关的因子。所有的结果揭示虽然Bm9并不是BmNPV增殖的必需基因,但Bm9与病毒在体内和体外的感染性和毒力直接相关。 BmNPV ORF56(Bm56)是杆状病毒的核心基因之一,其同源基因存在于所有已测序的杆状病毒中。本研究中我们进一步确定了Bm56是ODV的核衣壳蛋白。而且,我们利用能够在大肠杆菌中复制的BmNPV bacmid构建了敲除Bm56的bacmid,并分析了敲除Bm56的bacmid在细胞里的复制情况。Bm56敲除的bacmid与BmNPV bacmid相比在BV产量上并没有统计学上的区别。另外,体内的生测分析显示这两种bacmid在半致死剂量(LD_(50))上也没有统计学上的区别。但是,Bm56敲除的bacmid比BmNPV bacmid杀死虫体要更长时间。这说明,Bm56作为ODV核衣壳的结构成分,有利于病毒在体内有效复制,但不影响在离体细胞中产生BV的。 同时,我们制备了BmNPV基因芯片,分析了BmNPV全基因的转录图谱,并就Bm9基因敲除对BmNPV全基因组转录的影响进行了分析,发现Bm9基因敲除后,lef11,egt,ORF35,ubquitin,bro-b和dbp转录水平极显著下降,ORF45和ORF44转录显著下降,而p6.9,bro-d,ORF67,helicase,pe38,ie-2和ie-1 7个基因转录水平显著上升。dbp和lef11转录水平下降有可能是Bm9基因敲除导致BV产量下降的原因。结果为杆状病毒基因功能的进一步深入研究提供基础。


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