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《浙江大学》 2008年
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柿树炭疽菌基因组文库构建及致病性相关突变体的筛选分析

孙虎  
【摘要】: 柿树炭疽病(Persimmon anthracnose)是由胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides Penz.)侵染造成的,在全世界产柿国家均有发生。近年来,随着浙江省淳安地区无核柿(Diospyros kaki cv.Wuheshi)的大面积栽种,柿树炭疽病趋于严重。本实验室已对病原菌、发病规律、致病机理及与寄主互作机制进行了系统研究,然而,许多工作仅局限在细胞学水平上。利用分子生物学技术分离和鉴定柿树炭疽菌的致病相关基因,是了解柿树炭疽菌致病机理及互作机制的重要手段,不仅在植物病理学上有重要意义,而且也为生产上进一步探索新的防病途径提供线索。因此,本文采用SuperCos1载体构建了基因组文库,同时用(Agrobacterium tumefaciens mediated-transformation)ATMT技术进行了柿树炭疽菌的转化,并对致病性相关的基因进行了克隆。 1基因组文库构建 采用SuperCos1载体构建了胶孢炭疽菌基因组文库。建立了SDS及蛋白酶K提取高质量基因组DNA的方法,酶切可获得大小约40 kb DNA片段。片段被连接和包装后,转染XL1-Blue MR细菌,最终获得4.0×10~4个粘粒克隆(每微克基因组DNA约产生10~5个粘粒克隆)。它们混合在15%甘油中,保存于-70℃条件下。通过对50个随机重组子分析表明,98%的重组子克隆中含有外源DNA片段,平均大小为40.5 kb。按照胶孢炭疽菌基基因组DNA为50 Mb计算,库容量已高达31.75,理论上从该文库中筛选到任一DNA序列的精确概率高达99.9%。对扩增保存后文库菌液滴度测定显示,该文库滴度约为4.6×10~8 cfu/ml。当进行3次反复冻融后,其滴度仍可达4.0×10~8 cfu/ml。以上结果表明,构建的粘粒基因组文库质量比较高,符合筛选目的基因的要求。 2农杆菌介导的柿树炭疽菌转化及突变体筛选 本试验中,首先将构建的双元载体pATMT1通过电转化法导入农杆菌AGL-1中,然后AGL-1菌液与800μl的1×10~6/ml柿树炭疽菌TSG001分生孢子在乙酰丁香酮(AS)的培养基上共培养。经过两轮hyg抗性筛选后共获得787个转化子,转化效率高达900转化子/10~6个分生孢子。对随机挑选的14个转化子进行PCR验证表明,含有T-DNA的转化子比率达92.8%。通过表型分析,筛选出22个生长速度变异的转化子,30个菌落颜色变化的转化子,32个产孢能力减弱的转化子和18个孢子形态变异的转化子。通过致病性试验测定,获得5个弱致病性和6个无致病性转化子。 3无致病性突变体分析 生物学特性分析进一步对6个无致病性突变体进行分析,Cg-10、Cg-32、Cg-305、Cg-573、Cg-608和Cg-613与野生型TSG001生长速度均存在显著性差异,在菌落形态及颜色方面也存在较为明显的变异。6个转化子中,产孢量均显著低于TSG001菌株(187.5×10~6孢子/皿),其中,Cg-10、Cg-32、Cg-305和Cg-608产孢量均不到野生型产孢量的1/100;同时6个转化子分生孢子形态之间也存在较大差异。除Cg-608孢子萌发率(80%)及附着孢形成率(75%)与野生型TSG001无显著差异外,其余5个突变体均显著低于野生型。其中,Cg-32及Cg-613的分生孢子萌发率仅为2%,Cg-613附着孢形成率更是仅为1%,而突变体Cg-32在整个孢子萌发试验中未见任何附着孢产生。 T-DNA插入拷贝数鉴定Southern杂交结果显示,突变体Cg-305为3拷贝突变体,Cg-608为双拷贝突变体,其它4个突变体Cg-10、Cg-32、Cg-573、Cg-613均为T-DNA单拷贝插入。 单拷贝无致病性突变体侧翼序列分析根据T-DNA插入序列设计引物,采用反向PCR、TAIL-PCR及高效TAIL-PCR扩增出Cg-10和Cg-32的左右臂侧翼序列及Cg-613的右臂侧翼序列。通过序列编辑并进行Blastn搜索,结果表明,三个无致病性突变体Cg-10、Cg-32和Cg-613 T-DNA插入位点侧翼序列分别与24-C甲基转移酶、核糖体蛋白S11和真核翻译起始因子3三个致病性相关基因具有较高同源性。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S436.65

【引证文献】
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【同被引文献】
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