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柿树炭疽菌突变体致病性及相关基因的克隆

张丽丽  
【摘要】: 柿树炭疽病(Persimmon anthracnose)是由胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides Penz.,在本文中也称柿树炭疽菌)侵染造成的,在全世界产柿国家均有发生。柿树炭疽病最近几年在浙江严重发生,已成为影响柿树产业发展的限制因素。为深入了解病原菌-寄主植物互作的机制,本试验室用农杆菌介导转化柿树炭疽菌,获得了致病相关的突变体,并构建柿树炭疽菌基因组文库。在此基础上,本文主要从突变体形态学、侵染寄主的细胞学方面进行研究,并进行致病相关基因的克隆。 1柿树炭疽菌突变体形态学的研究 在培养条件下,观察了9个胶孢炭疽菌突变体(Cg-10、Cg-32、Cg-573、Cg-613、Cg-371、Cg-387、Cg-522、Cg-587和Cg-605)的培养性状和形态特征,并对不同突变体的菌落和分生孢子形态特征与野生型对照进行了比较分析。 突变体菌落特征观察表明,突变体Cg-371、Cg-387、Cg-522和Cg-605与野生型对照相似,其余5个突变体变与对照相比,变化较大。此外,与对照相比,突变体菌株产孢量都较少,尤其是突变体Cg-10与Cg-522几乎观察不到菌落上有分生孢子的存在。 分生孢子形态观察表明,突变体Cg-32、Cg-522和Cg-573孢子形态变化最大,突变体Cg-32、Cg-522中的许多孢子呈现卵圆形,而Cg-573的一些孢子呈现哑铃形。6个突变体Cg-10、Cg-573、Cg-613、Cg-371、Cg-387、Cg-587和Cg-605的分生孢子形态与对照相似。差异显著性结果显示,所有突变体的分生孢子长度均与对照有显著差异,而突变体的分生孢子宽度与对照相比差异不明显,只有突变体Cg-10、Cg-371、Cg-522和Cg-371与对照差异显著,其它突变体与对照相比无显著差异。其中,突变体Cg-522不论是分生孢子的长度还是分生孢子的宽度均与其它菌株差异显著。 2致病性试验 接种无核柿新梢和叶柄的致病性试验显示,只有突变体Cg-32无致病性,其余8个突变体Cg-10、Cg-371、Cg-387、Cg-522、Cg-573、Cg-587、Cg-605和Cg-613在70小时后都出现病斑。但与野生型对照相比,突变体产生的病斑相对较小。 3突变体侵染寄主的细胞学观察 接种98 h后取样,切取寄主表皮组织,经脱色、染色后,在显微镜下观察侵染过程。观察结果表明,突变体Cg-371、Cg-387、Cg-587、Cg-605、Cg-613在侵入的寄主细胞内产生了初生菌丝或侵染泡囊,没有观察到次生菌丝形成;突变体Cg-32、Cg-10、Cg-522和Cg-573从附着孢上产生了侵染钉,但没有侵染泡囊的形成。野生型对照菌株TSG001中,不仅观察到有初生菌丝产生,也有次生菌丝形成。 4 Southern杂交分析 用5个柿树炭疽菌突变体Cg-371、Cg-387、Cg-522、Cg-587和Cg-605的基因组DNA,进行PCR检测和Southern杂交。PCR检测结果显示,5个柿树炭疽菌突变体基因组DNA中均插入了T-DNA。Southern杂交结果表明,只有突变体Cg-371杂交出现一条单拷贝带,其它4个突变体均无杂交条带出现。 5突变体侧翼序列的扩增 采用反向PCR的方法扩增突变体Cg-371的侧翼序列,获得了T-DNA插入位点的左臂侧翼序列,其大小为364bp。将扩增序列递交到NCBI网站进行BLAST搜索,结果显示,Cg-371序列中47-257bp的211bp序列同Magnaporthe grisea菌株70-15的hypothetical protein(MGG_01057)部分mRNA中部分序列同源性达到100%。 采用高效TAIL-PCR(hiTAIL-PCR)的方法扩增突变体Cg-573侧翼序列,扩增出了T-DNA插入位点的左臂侧翼序列,其大小为275bp。该序列经过BLAST搜索,没有找到高度同源序列。


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