收藏本站
《浙江大学》 2008年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

5-氨基乙酰丙酸脱水酶的克隆表达与酶学性质的初步研究

杨佳倩  
【摘要】: 5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)是生物体内四吡咯化合物(如亚铁血红素、卟啉、叶绿素和维生素B_(12)等)的共同前体,广泛存在于微生物、植物和动物细胞中。近年来,研究发现ALA不仅可作绿色除草剂和生物杀虫剂,还可用于癌症治疗、皮肤病治疗、铅中毒检测等领域,是一种非常有前途的光动力学药物。 本实验室已利用生物体内的碳四途径,成功构建了高产ALA的重组大肠杆菌。通过过量表达ALA合成酶催化琥珀酰辅酶A和甘氨酸的缩合反应,使得AlA的发酵水平到达了6.6g/L(50 mM)。 5-氨基乙酰丙酸脱水酶(ALAD,又名胆色素原合成酶PBGS,E.C.4.2.1.24)能够催化两分子ALA不对称缩合形成胆色素原。作为ALA代谢途径的下游酶,在重组工程菌的发酵生产过程中,脱水酶会导致ALA积累量的减少,但缺乏该酶又会影响细胞的正常生理活动。因此,深入了解ALAD的酶催化动力学特征,采用一定的手段在产ALA期间部分抑制ALAD的活性,就有可能进一步提高ALA产量。 本工作将大肠杆菌Rosseta(DE3)的ALAD基因(hemB)克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)上,重组质粒命名为pET28a-hemB。将pET28a-hemB转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,成功构建了重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-hemB,并使融合蛋白带上6His亲和标签。重组菌经1mM IPTG诱导表达后,SDS-PAGE结果显示,在36.5 kD处蛋白获得过量表达,经改良的Ehrlich试剂显色反应测定ALAD活力,结果发现重组ALAD比活力达到3.10×10~3U/mg protein。 研究重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-hemB生产5-氨基乙酰丙酸脱水酶的诱导条件,确定了摇瓶发酵的最优诱导条件为:发酵开始后2h添加诱导剂,诱导剂IPTG终浓度为0.4 mM,诱导后的培养温度为28℃,诱导后的表达时间以4 h为宜。通过亲和层析、凝胶过滤层析和冷冻干燥三个步骤得到5-氨基乙酰丙酸脱水酶纯品。经过整个分离纯化过程,5-氨基乙酰丙酸脱水酶的比活力提高了6.19倍。 对重组ALA脱水酶进行了一系列酶学性质的研究,该酶的最适pH值为7.5,最适反应温度为37℃,Km为0.569 mM,Mn~(2+)、Ca~(2+)和K~+能够显著提高酶活力,Cu~(2+)和Li~+显著抑制了酶活力,10 mM金属离子螯合剂EDTA可导致近90%的酶活力丧失,Mg~(2+)对酶活性起着重要作用,低浓度的二硫苏糖醇能够提高ALA脱水酶活性,底物类似物乙酰丙酸、D-葡萄糖以及D-木糖对该酶有着显著的抑制作用。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:Q78

手机知网App
【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 郝晓然;大蒜绿变过程中几种关键酶活性变化规律的研究[D];山东农业大学;2012年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前7条
1 谢秀祯;黄循吟;韩向红;;提高类球红细菌5-氨基乙酰丙酸产率的措施[J];工业微生物;2005年04期
2 张涛铸,谢幸殊,张嗣良,叶勤;γ干扰素工程菌发酵工艺研究[J];华东化工学院学报;1993年02期
3 刘秀艳,徐向阳,陈蔚青;光合细菌产生5-氨基乙酰丙酸(ALA)的研究[J];浙江大学学报(理学版);2002年03期
4 赵春晖,穆江华,林建平,岑沛霖;异养培养光合细菌产5-氨基乙酰丙酸发酵条件的研究[J];精细化工;2003年11期
5 张一宾 ,周燚;5-氨基乙酰丙酸的植物生理活性[J];世界农药;2000年03期
6 崛田康司 ,蒋卫平;5—氨基乙酰丙酸对两种草坪生长的影响[J];青海草业;2001年04期
7 赵春晖;林建平;刘晓侠;穆江华;岑沛霖;;过量表达自身hemA基因的重组大肠杆菌发酵生产5-氨基乙酰丙酸的研究[J];生物加工过程;2005年04期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 郭晓青;李超汉;李青竹;李霞;李衍素;于贤昌;;叶面喷施5-氨基乙酰丙酸对遮阴条件下番茄生长、光合特性和产量的影响[J];山东农业科学;2011年09期
2 李翠花;邹华文;;不同植物生长物质处理对玉米幼苗生理指标的影响[J];安徽农学通报(上半月刊);2009年09期
3 马海元;李海云;任秋萍;;园艺植物抗冷生理研究进展[J];安徽农业科学;2009年08期
4 张志娟;王素英;林媛;;PEG/磷酸盐双水相体系萃取青霉TS67胞外活性蛋白的研究[J];安徽农业科学;2009年17期
5 陈佳宁;王娟;李立芹;;马铃薯试管薯诱导体系的研究进展[J];安徽农业科学;2010年23期
6 李美善;刘宪虎;许明子;邱献锟;赵孝东;李玉花;刘桂英;;5-氨基乙酰丙酸处理对水稻籽粒增重的影响[J];安徽农业科学;2010年33期
7 吴少辉;彭芳;高鹏飞;巫秀美;何苗;张成桂;刘光明;;膜超滤分离美洲大蠊抗肿瘤活性部位小分子肽的研究[J];安徽农业科学;2012年04期
8 郑楠;朱建航;刘杰;;牛血清白蛋白在聚乙二醇/葡聚糖双水相体系中分配特性的研究[J];氨基酸和生物资源;2006年03期
9 何晓梅;周静;范军;朱苏文;程备久;;重组酿酒酵母5-氨基酮戊酸合酶在大肠杆菌的表达[J];安徽农业大学学报;2006年04期
10 罗佳;邹志荣;;施用ALA对不同棚龄蔬菜大棚番茄硝酸盐累积的影响[J];北方园艺;2007年12期
中国重要会议论文全文数据库 前5条
1 杨蕊;邹志荣;;ALA肥料对盐胁迫下黄瓜生长发育的促进作用[A];2008园艺学进展(第八辑)——中国园艺学会第八届青年学术讨论会暨现代园艺论坛论文集[C];2008年
2 王燕;朱俊;张风霞;程华;常杰;许锋;程水源;;5-氨基乙酰丙酸对银杏叶光合作用及黄酮含量的影响[A];2008园艺学进展(第八辑)——中国园艺学会第八届青年学术讨论会暨现代园艺论坛论文集[C];2008年
3 方希修;王冬梅;管军军;乐国伟;;超滤/DEAE离子交换层析法分离纯化IgY的研究[A];2009山东饲料科学技术交流大会论文集[C];2009年
4 曹冰玉;王永山;范红结;欧阳伟;王忠灿;唐雨德;;近期引起免疫失败的传染性法氏囊病病毒VP2基因在大肠杆菌中的表达[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第二次学术研讨会论文集[C];2010年
5 余献国;余子婴;李靖;;生命科学进展中膜科学技术的机遇及发展前景[A];第五届全国医药行业膜分离技术应用研讨会论文集[C];2012年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 康振;大肠杆菌系统改造及琥珀酸和5-氨基乙酰丙酸合成途径的构建[D];山东大学;2011年
2 成飞雪;光合细菌代谢产物5-氨基乙酰丙酸杀线虫作用及其机理研究[D];湖南农业大学;2011年
3 王泽建;宏观和微观代谢分析相结合的系统生物过程研究—维生素B_(12)发酵过程优化[D];华东理工大学;2011年
4 Saba Ambreen Memon;ALA促进不结球白菜耐盐机理的研究[D];南京农业大学;2008年
5 龙明秀;关中地区紫花苜蓿品种优势性比较研究[D];西北农林科技大学;2011年
6 申烨华;重组人γ-干扰素生产工艺优化及α-糜蛋白酶复性研究[D];西北大学;2001年
7 潘韵;重组人肝再生增强因子(rhALR)的表达、纯化及生物活性研究[D];浙江大学;2003年
8 张松平;蛋白质色素亲和色谱理论研究[D];天津大学;2003年
9 何卫中;用加压CO_2从乙醇-水溶液中沉淀蛋白质的研究[D];浙江大学;2002年
10 欧昌荣;褐藻胶寡糖的制备、分析及其应用研究[D];中国海洋大学;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张星刚;双水相萃取光度法测定铬(Ⅵ)、镍(Ⅱ)、锌(Ⅱ)的研究与应用[D];山东科技大学;2010年
2 张宽亮;含有红色荧光报告基因玉米CobA的T载体和表达载体构建研究[D];安徽农业大学;2010年
3 张帆;外源物质对辣椒幼苗抗冷性的影响[D];甘肃农业大学;2010年
4 杨君丽;大豆抗氧化肽的制备与表征[D];河南工业大学;2010年
5 唐雪珍;微米级亲和凝胶载体的制备及其亲和吸附蛋白质研究[D];华东理工大学;2011年
6 谢芳;生姜蛋白酶的双水相萃取纯化技术研究[D];山东农业大学;2011年
7 侯珊珊;花生条纹病毒分子变异分析和马铃薯Y病毒蛋白的表达纯化[D];山东农业大学;2011年
8 郭晓青;亚适宜温光条件下ALA对番茄生理特性的影响[D];山东农业大学;2011年
9 张帆;双水相萃取偶联柱层析分离纯化重组白蛋白[D];大连理工大学;2011年
10 柳翠霞;外源5-氨基乙酰丙酸对弱光下黄瓜幼苗生长的影响[D];西南大学;2011年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 刘子乾;杨以兵;周向东;徐兴国;;金乡县大蒜产业发展现状与对策[J];山东农业科学;2008年05期
2 郭红珍;姚越红;王秋芬;;大蒜抑菌作用的研究[J];安徽农业科学;2007年02期
3 韩素梅;姜新菊;夏卫国;;邳州地区大蒜产业发展现状与对策[J];现代农业科技;2009年23期
4 和红云;薛琳;田丽萍;陈远良;;低温胁迫对甜瓜幼苗叶绿素含量及荧光参数的影响[J];北方园艺;2008年04期
5 姜华武,王琳;大蒜鳞茎休眠解除后的生理生化变化[J];湖北农学院学报;1998年04期
6 夏玉凤,孙新立,冯小燕,王友爱;琥珀酸脱氢酶的纯化研究[J];河北师范大学学报;2000年04期
7 沈宏,严小龙,郑少玲,王秀荣;菜豆有机酸和无机阴离子同时分析的离子色谱法[J];华南农业大学学报;2001年02期
8 崔海瑞,夏英武,高明尉;温度对水稻突变体W1叶色及叶绿素生物合成的影响[J];核农学报;2001年05期
9 陶华君;大蒜在我国的开发利用现状、存在问题及对策[J];粮食与食品工业;2004年04期
10 周德庆,林洪,楼伟风,李兆杰;辐照和温度对大蒜保鲜作用的研究简报[J];莱阳农学院学报;1996年03期
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 罗安才;柑桔果实有机酸代谢生理和奉节脐橙芽变株系的AFLP分析研究[D];西南农业大学;2003年
2 赵晓丹;醋浸绿蒜的功能及其绿变色素的分离、性质研究[D];中国农业大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前7条
1 牟聪华;大蒜绿变色素生物合成途径的研究[D];山东农业大学;2011年
2 李蕾;大蒜绿变机理初探[D];中国农业大学;2005年
3 陈小峰;豌豆胆色素原脱氨酶新型表达载体构建与定点突变[D];安徽农业大学;2005年
4 王岩;大蒜绿色素提取、分离及其性质的研究[D];山东农业大学;2006年
5 朱娟;含组氨酸标签的枯草杆菌5-氨基酮戊酸脱水酶性质研究[D];安徽农业大学;2006年
6 赵飞;γ-谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶与大蒜绿变的关系[D];山东农业大学;2008年
7 陈聪;大蒜绿变色素分离纯化及结构鉴定[D];山东农业大学;2008年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 刘秀艳,徐向阳,陈蔚青;光合细菌产生5-氨基乙酰丙酸(ALA)的研究[J];浙江大学学报(理学版);2002年03期
2 赵春晖,穆江华,林建平,岑沛霖;异养培养光合细菌产5-氨基乙酰丙酸发酵条件的研究[J];精细化工;2003年11期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王初升,尹卫平,林岳夫,陈荣忠,周秀兰,杨丰;泥蚶血液中δ-氨基乙酰丙酸脱水酶的测定[J];台湾海峡;1985年02期
2 范立强,袁勤生,吴祥甫;双质粒系统共表达大肠杆菌肉碱脱水酶基因caiB及其辅酶合成基因caiE[J];生物化学与生物物理学报;2002年01期
3 程佑发,浦铜良,张承烈,薛勇彪;沙芦茎高效表达的胸腺嘧啶二磷酸葡萄糖脱水酶与水分胁迫相关[J];科学通报;2001年07期
4 孙博;刘志敏;游松;;1,3-丙二醇生产的研究进展[J];生物技术通讯;2008年05期
5 吕新芳!100050北京,吕京!100050北京,崔涛!100050北京,贺锡雯!100050北京;中国维吾尔族和彝族人群δ-氨基-γ-酮戊酸脱水酶基因多态性的分析[J];中华劳动卫生职业病杂志;2001年03期
6 于寒颖;杨谦;周东坡;金红星;;核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)arom基因3′-末端的克隆与分析[J];黑龙江大学自然科学学报;2005年05期
7 杨洁芳;梁华;樊建康;闭中强;;猕猴铅毒性诊断指标测定结果[J];实验动物与比较医学;1992年04期
8 项艳,范军,朱苏文,李纯,程备久;对生玉米5-氨基酮戊酸脱水酶的简单快速纯化[J];安徽大学学报(自然科学版);1999年02期
9 S·瓦特;李宏明;;在诱发昆虫产生抗药性的过程中起关键作用的酶[J];世界科技研究与发展;1990年05期
10 王玉萍,谭训刚,陈师勇,王勇,王静,李翔太;肉碱脱水酶突变株的获得及其休止细胞反应条件的优化[J];生物技术通讯;2000年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 杨仲丽;方柏山;李梓君;朱春杰;;丁酸梭菌中甘油脱水酶及其再激活酶基因的克隆表达[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
2 李雯君;方柏山;洪燕;王晓霞;林锦霞;刘桂兰;;甘油脱水酶再激活酶的克隆表达及活性鉴定[A];第三届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(上)[C];2006年
3 韦旭钦;陈发忠;韦宇拓;齐向辉;黄日波;;甘油脱水酶的定向进化及其高通量筛选方法[A];第三届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(上)[C];2006年
4 齐向辉;韦旭钦;杨登峰;吴杰群;孟晓蕾;唐悦;梁甜;杜丽琴;韦宇拓;黄日波;;一步法发酵葡萄糖生成1,3-丙二醇的基因工程菌的构建及分子改性[A];2005热带亚热带微生物资源的遗传多样性与基因发掘利用研讨会论文集[C];2005年
5 郑艳;管艺飞;刘长江;;甘油脱水酶基因(gldABC)与1,3-丙二醇氧化还原酶基因(dhaT)的共表达[A];科学发展与社会责任(A卷)——第五届沈阳科学学术年会文集[C];2008年
6 周瑞芳;吳國利;;小白鼠肝臟中蘇氨酸脫水酶誘導生成性質的研究[A];中国生理科学会学术会议论文摘要汇编(生物化学)[C];1964年
7 朱建国;李霜;纪晓俊;黄和;;1,3-丙二醇氧化还原酶基因(dhaT)在Klebsiella pneumoniae中的表达研究[A];第三届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(上)[C];2006年
8 冯宝珍;李艳青;付丽;王会征;李培谦;王和美;王秀菊;张修国;;辣椒疫霉菌的几个重要功能基因的作用机制研究[A];2010年中国菌物学会学术年会论文摘要集[C];2010年
9 赵莉;王娅君;宫衡;马兴元;魏东芝;郑宇;徐佳杰;;克雷伯氏菌发酵生产1,3-丙二醇过程中关键酶及相关蛋白动态变化的研究[A];第三届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(上)[C];2006年
10 江剑辉;;高苯丙氨酸血症中的四氢生物蝶呤缺乏症和枫糖尿病的诊断、鉴别诊断和治疗[A];全国儿童营养及苯丙酮尿症研讨会论文集[C];2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 徐小琳;Klebsillae pneumoniae XJPD-Li重组甘油脱水酶特性及其复活动力学研究[D];天津大学;2010年
2 徐芳芳;柔性金属对大肠杆菌毒性机理的研究[D];东华大学;2012年
3 傅维琦;产5-氨基乙酰丙酸重组菌的优化和发酵过程调控研究[D];浙江大学;2009年
4 邱晓挺;突触结合蛋白C2结构域和甘露糖酸脱水酶的结构生物学研究[D];中国科学技术大学;2012年
5 刘雪娇;Fostriecin生物合成相关基因功能的研究[D];大连理工大学;2013年
6 王芬;变构菌素生物合成相关基因功能的研究[D];大连理工大学;2013年
7 马正;利用不同底物生产1,3-丙二醇及基因工程菌的构建[D];江南大学;2010年
8 周玉岩;吉他霉素生物合成基因簇克隆与基因工程菌株构建[D];甘肃农业大学;2012年
9 门丽娜;兴安落叶松不同生长时期诱导防御基因表达谱的变化[D];东北林业大学;2012年
10 姜春艳;聚醚类抗生素盐霉素的生物合成机制[D];上海交通大学;2013年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 吕波;K.pneumoniae XJPD-Li甘油脱水酶高效催化特性的研究[D];石河子大学;2009年
2 杜好勉;利用甘油脱水酶基因构建产3-羟基丙醛工程菌及其表达比较[D];江南大学;2012年
3 涂志林;柔嫩艾美耳球虫β-羟酰-ACP:脱水酶生化特性及抑制动力学研究[D];南京农业大学;2009年
4 庄文超;1,3-丙二醇合成途径中关键酶的研究[D];燕山大学;2011年
5 聂玲燕;克雷伯氏菌高产1,3-丙二醇菌株选育及关键酶基因转录调控研究[D];江南大学;2012年
6 李天伯;黑暗链霉菌S.tenebrarius H6中与抗生素有关生物合成基因的克隆[D];沈阳药科大学;2001年
7 权国燕;3-羟基丙酸合成途径关键酶及再激活因子基因在大肠杆菌中的表达研究[D];江南大学;2011年
8 陈祥军;腺苷钴胺素合成酶基因cobs的克隆及在产1,3-丙二醇菌中的应用[D];江南大学;2010年
9 翟伟锋;辅酶B_(12)合成菌的筛选及相关合成基因的克隆表达和应用[D];江南大学;2011年
10 曹宁;基于λ-Red重组系统构建3-羟基丙酸工程菌[D];北京化工大学;2013年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026