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《浙江大学》 2007年
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土曲霉固态发酵产洛伐他汀的关键技术和新工艺探索

魏培莲  
【摘要】: 洛伐他汀(Lovastatin)是一种重要的降胆固醇药物,目前主要采用土曲霉(Aspergillus terreus)液体深层发酵的方法生产。根据土曲霉的菌丝生长特性及洛伐他汀为胞内产物的特点,本文提出了采用土曲霉固态发酵生产洛伐他汀,并系统地研究了其中的关键问题。 在固态发酵中,准确测定生物量是一项非常重要但又尚未很好解决的问题。本文对三种细胞组分(核酸、麦角固醇、氨基葡萄糖)作为生物量测定指标的方法进行了比较研究,发现土曲霉菌体中的核酸、麦角固醇和氨基葡萄糖含量都分别与菌体量存在较好的正线性关系。但菌体中麦角固醇含量受培养时间和培养基成分的影响较大;氨基葡萄糖量虽不受培养时间的影响,但与培养基成分的关系密切。因此上述二种细胞组分都不是测定生物量的最优选择。菌体中的核酸含量基本不受培养时间和培养基的影响,且测定方法简单,适合于土曲霉和红曲霉固态发酵时生物量的精确测定。 考察了A.terreus ZJU-510菌株的生理和菌丝生长特性。土曲霉具有一定的淀粉酶活和纤维素酶活,适合在富含淀粉和纤维素的固态基质上生长,但在不同培养基上的生长形态差异较大:在马铃薯琼脂培养基上,菌丝的生长较弱,容易产生孢子;在查氏培养基和麦芽汁培养基上,菌丝生长较好而产孢子较少;在大米基质上,土曲霉较容易产孢子,菌丝生长较差,而且底物的利用不完全。由于洛伐他汀是菌丝体内的产物,固态发酵中控制孢子生成是需要注意的重要问题。 在三角瓶中系统地优化了土曲霉固态发酵产洛伐他汀的条件,通过单因素实验,得到了土曲霉固态发酵产洛伐他汀的较优培养基组成和发酵条件,采用二段固体发酵工艺(先32℃培养3天,然后28℃培养8天),洛伐他汀的固态发酵产量达到了3.36mg/g干曲。考察了固态发酵过程中产物、基质含水量和pH值等主要发酵参数的变化规律,研究了lovastatin合成的动力学,发现在固态发酵的1-5天内,菌丝量和洛伐他汀的含量快速增加,以后则增加缓慢,至11天达到最高值。说明洛伐他汀虽然属于次级代谢产物,但与菌丝生长仍有一定的相关性。进一步利用响应面优化法对固态发酵生成洛伐他汀的培养基和培养条件进行了系统优化,所获得的最佳发酵条件为:在大米培养基中添加乙酸钠0.54%、葡萄糖3.36%、蛋白胨1.5%,基质初始含水量为45%,接种量为25%。在此条件下洛伐他汀产量为3.99 mg/g干曲,比未优化前的产量3.36 mg/g提高了18.8%。 在小型自制固态发酵罐中,考察了基质装量、翻料操作以及通气情况对发酵的影响,并测定了发酵过程中曲料温度变化曲线。比较了三角瓶培养、浅盘培养和小型发酵罐培养的结果进行了比较,结果表明,尽管浅盘培养和发酵罐培养的产量都略低于三角瓶培养,但由于小型发酵罐的通气性优于浅盘培养,洛伐他汀的产量也较高。建立了能够较好反应土曲霉菌体生长、底物消耗和洛伐他汀合成的动力学模型,从而为进一步的固体发酵放大研究奠定了良好的基础。 在上述研究工作中,发现土曲霉固态发酵的洛伐他汀产量高于红曲霉,但由于淀粉酶活力较弱,影响了其对固态底物的利用,使菌丝生长较差,容易产生孢子。红曲霉菌株本身具有合成洛伐他汀的能力,而且产淀粉酶活力也较高。研究表明,A terreusZJU-510和M rubber M7双菌株混合固态发酵能够达到优势互补,M rubber M7菌株的高淀粉酶活可以有效地弥补A terreus ZJU-510的不足,促进A.terreus ZJU-510菌株在固态基质中生长,从而提高固态基质中的菌体生物量和洛伐他汀的产量。 利用基因组重排技术对土曲霉洛伐他汀的高产菌株进行了选育。利用洛伐他汀浓度梯度平板和淀粉琼脂平板,筛选耐洛伐他汀和高产淀粉酶的突变株,并通过摇瓶液体培养验证洛伐他汀产量。采用UV+LiCl和DES诱变育种,筛选出了六株菌株作为出发菌,然后经过三轮基因组重排育种,获得了一株高产突变株GS-185,在优化的固态发酵条件下,该菌株的洛伐他汀产量达到了8.17mg/g干曲,约是原始出发菌株的产量3.99mg/g的2倍。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:TQ463.2

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