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自发性高血压大鼠肾脏组织蛋白质表达谱的研究及氯沙坦对其的影响

余敏  
【摘要】: 高血压病是一种常见病、多发病,严重危害着人类的健康。据估计世界范围内约有25%的成人患有此病,我国目前大约有1亿多高血压患者,而且高血压的发病率还在逐年增加之中。大量流行病学和临床实验都已证明高血压是大多数心血管疾病、肾脏疾病和周围血管疾病的重要致病原因。高血压已成为全球共同面临的主要公共健康问题之一。肾脏既是体内调节血压的重要器官,同时又是高血压损害的主要靶器官之一。肾功能的受损将进一步恶化高血压的发展。近年来研究认为肾素—血管紧张素—醛固酮系统(RAS)的激活可能在高血压性肾损害中起着重要的作用。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是RAS中重要的活性物质,可以刺激多种蛋白质分子(转化生长因子,骨桥蛋白等)的表达增加,进而引起肾脏的损害。氯沙坦是临床上广泛应用的一种AngⅡ受体拮抗剂,其降压,保护肾脏的作用已为大量临床试验所证实,然而其肾脏保护作用的确切机制仍未明了。 尽管人类基因组计划已经完成,然而依靠基因水平的分析有时并不足以了解疾病发生的机制,大部分疾病的发生与蛋白质的表达有关。对基因表达产物蛋白质的研究才是揭示生命活动和疾病机制的最终阶段,由此在基因组学的基础上产生了蛋白质组学这门新兴学科。蛋白质组是指一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质,而蛋白质组学则是应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门学科。其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成分、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。双向凝胶电泳以及质谱分析是蛋白质组研究中的主要技术,可同时分离成百上千种蛋白质并进行鉴定。尽管蛋白质组学的提出迄今不过十来年时间,却发展迅速,已广泛深入到生物医学的各个领域,在发现疾病的标志分子,阐明疾病的分子机制,研究药物新靶点等方面有着广泛的应用。通过比较正常、高血压时以及抗高血压药物治疗后肾脏组织蛋白质在表达数量、表达位置和修饰状态上的差异,有可能发现与高血压性肾脏损害相关的特异蛋白质,这些蛋白质既可为高血压性肾损伤的发病机制提供线索,也可作为疾病诊断的分子标志,还可作为治疗和药物开发的靶标,具有重要的理论和实际意义。 本实验以自发性高血压大鼠为研究对象,选取雄性6周龄的Wistar Kyoto大鼠6只和同周龄的自发性高血压大鼠(SHR)12只,SHR又随机分为高血压组及高血压药物干预组(Losartan组)。降压药物氯沙坦溶于水中,按每只大鼠20mg/kg/day的剂量喂给,根据大鼠体重,每周调整药物剂量一次。每周测量大鼠血压、体重。8周后处死大鼠取肾脏组织,提取组织蛋白。另取部分肾组织HE染色,用于观察肾组织病理形态学变化。蛋白浓度采用Bradford法测定。取蛋白样品200μg进行双向凝胶电泳,凝胶用硝酸银进行染色,银染的凝胶扫描后用Imagemaster 2D v5.0软件进行分析,将分析发现的差异蛋白点切下,酶解消化,取消化后的多肽混合物进行质谱鉴定,将所得的肽质量指纹图谱输入到Mascot软件中搜索NCBInr蛋白质数据库以确定蛋白质的归属。并对鉴定出的蛋白质用western blot方法进行证实。 结果:(1)6周时,与WKY相比,SHR大鼠的血压已明显升高(150.72±5.07 VS 110.11±3.74,p<0.01),随着周龄的增加,SHR大鼠的血压也随之增加,而WKY大鼠血压无明显变化。给予氯沙坦治疗两周后,SHR大鼠血压已明显降低(162.33±8.86 VS 142.22±13.40,p<0.05),连续应用8周,降压作用明显而稳定。(2)14周龄时,SHR大鼠肾小动脉已可见病理上的改变,动脉血管管壁增厚,管腔变窄;给予氯沙坦治疗8周后,肾小动脉血管管壁增厚的程度有所减轻。(3)对蛋白样品进行双向凝胶电泳,染色,成功建立了正常、高血压及氯沙坦干预后大鼠肾脏组织的蛋白质表达谱。三组凝胶检测到的蛋白点数分别为1144±35、1215±78、1219±44。与WKY组相比较,SHR组肾脏表达有差异的蛋白有25个,其中表达增强的蛋白点有9个(2,3,5,6,13,14,15,17和22号点),表达降低的蛋白点有6个(16,18,20,23,24和25号点),新出现的蛋白点有10个(1,4,7,8,9,10,11,12,19和21号点)。将这些点切下后进行质谱鉴定,11个点得到了鉴定。与WKY相比,SHR大鼠肾脏蛋白表达上调的点有5个:laminin gamma 2 chain precursor(spot 2,22),Tcrbprotein(spot 5),Aldo-keto reductase family 1 member A1(spot 6)和ribosomalprotein S2(spot 12);表达降低的点有2个:Hypothetical protein LOC361596(spot18)and RIKEN cDNA 2700081O15(spot 24);新出现的点有4个:BC030314protein(spot 1),enol protein(spot 4),laminin gamma 2 chain precursor(spot 8)andphosphatidylinositol transfer protein beta(spot 19)。使用氯沙坦治疗后,SHR大鼠肾脏6个蛋白点表达降低:分别是BC030314 protein(spot 1),enol protein(spot 4),Aldo-keto reductase family 1(spot 6),laminin gamma 2 chain precursor(spot 8)andphosphatidylinositol transfer protein beta(spot 19),laminin gamma 2 chainprecursor(spot 19);Hypothetical protein LOC361596(spot 18)和RIKEN cDNA2700081O15(spot 24)表达增加;另3个点laminin gamma 2 chain precursor(spot2),Tcrb protein(spot 5)和ribosomal protein S2(spot 12)的表达无明显改变。(4)spot 2,8和22点被鉴定为同一个蛋白laminin gamma 2 chain precursor。(5)银染法进行质谱鉴定的成功率为44%。(6)采用Western blot方法对4号点(Enolprotein)及18号点(Hypothetical protein LOC361596,也即是NADP~+-ICDH)的检测表明:Enol protein在SHR大鼠肾脏中表达明显升高,氯沙坦治疗后该蛋白表达明显降低;NADP~+-ICDH在高血压组表达明显降低,药物干预后表达增加,与双向电泳结果相一致。 结论:(1)6周龄时SHR大鼠的血压已明显升高,随着周龄的增加,SHR大鼠的血压也随之增加,14周龄时SHR大鼠肾小动脉已可见病理上的改变,SHR大鼠可用于高血压肾脏损害的研究。(2)氯沙坦治疗两周后,SHR大鼠血压已明显降低,持续给药,降压作用明显而稳定。(3)与WKY大鼠相比,高血压大鼠肾脏组织中有25个蛋白质的表达发生了明显的改变。其中有11个蛋白点得到了鉴定,部分蛋白点的表达能被氯沙坦逆转。这些蛋白质涉及到能量代谢、脂质转运、细胞增生等过程,这些蛋白质可作为进一步研究高血压性肾损害的靶点。(4)胶上不同位置的点被鉴定为同一个蛋白,可能与该蛋白存在异构体或在实验过程中被降解有关。(5)银染法用于质谱鉴定的成功率较低,更为灵敏而有效的染色方法对于提高差异蛋白的检出具有重要的意义。


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