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罗氏沼虾雄性生殖系统相关的Kazal型蛋白酶抑制剂(MRPINK)的生物学功能研究

李晔  
【摘要】: Kazal型蛋白酶抑制剂属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族,广泛分布在大多数的生物体中,参与调节生物的免疫防御,血液凝集和纤维蛋白水解,以及发育,生殖等生理过程。目前已有大量的Kazal型蛋白酶抑制剂被分离纯化,它们的结构和功能被报道。研究表明,典型的Kazal型结构域由50-60个氨基酸残基组成,其中六个半胱氨酸残基,以1-5/2-4/3-6的模式形成三对二硫键。在第二个半胱氨酸残基之后的第二个氨基酸位点被称为P_1位点,此氨基酸则被称为P_1残基。这一家族的蛋白酶抑制剂在空间结构上具有显著的特点,由一个紧密的支架和一个呈球状突起的结合环构成。P_1氨基酸残基和结合环在很大程度上决定着抑制剂的抑制特性。Kazal型蛋白酶抑制剂的抑制机理属于“标准型作用机理”,当抑制剂和蛋白酶相互作用时,P_1残基插入到蛋白酶的活性位点,结合环上的其他残基则通过不同的分子作用力影响两者结合。 在我们实验室原先的研究中,一种雄性生殖道相关的蛋白酶抑制剂(MRPINK)基因从罗氏沼虾中被克隆出来。该基因包含405bp的编码区,由21个氨基酸的信号肽和113个氨基酸的成熟肽链组成,构成两个Kazal型结构域。其特异性地在雄性生殖道中表达,并且被具体定位在生殖道中的分泌型上皮细胞。 在本研究中,我们对MRPINK和它的几个突变体成功地进行了原核表达,检测了它们对三种丝氨酸蛋白酶的抑制活性,分析了MRPINK的抑制特征和抑制机理,以及MRPINK两个结构域和P_1氨基酸残基对抑制剂活性的影响。同时我们还研究了MRPINK对罗氏沼虾精子活性的影响,以阐述这个抑制剂分子的生理功能。实验结果如下: 1.MRPINK和针对P_1位点构建的几个突变体(MRPINK~(L37K),MRPINK~(L37A),MRPINK~(L37G),MRPINK~(P88I))通过pET-28a(+)载体被成功地在大肠杆菌中进行了诱导表达;同时MRPINK的两个结构域domain1和domain2通过pET-32a(+)载体也被在大肠杆菌中成功地诱导表达。其中rMRPINK,rMRPINK~(L37K),rMRPINK~(L37A),rMRPINK~(L37G),和rMRPINK~(P88I)以包涵体的形式被表达;而domain1和domain2则以可溶性的形式被表达。根据不同的性质,这些重组蛋白通过Ni-NTA,分别在变性条件和非变性条件下被分离纯化。 2.通过分析重组蛋白对三种蛋白酶(Trypsin,Chymotrypsin,Thrombin)的抑制活性,表明MRPINK特异性地抑制chymotrypsin的活性,而对其它的两种蛋白酶没有抑制作用。进一步发现,MRPINK对chymotrypsin是一种典型的竞争性抑制,抑制常数K_i为354nM。其中domain2是具有抑制功能的结构域,抑制常数K_i为416nM。P_1 Pro对domain2的抑制活性发挥着关键性的作用。而对于domain1来说,不管P_1位点为Leu,Lys,Ala或者是Gly均没有表现出抑制活性。 3.我们进一步研究了rMRPINK对罗氏沼虾精子活性的抑制作用。结果发现精子提取物对卵膜蛋白的水解作用能够被MRPINK所抑制;明胶薄层(gelatinsubstrate film)分析显示,MRPINK对罗氏沼虾精子的水解明胶活性具有明显的抑制作用;通过免疫荧光分析揭示,MRPINK特异性地结合在精子的基体(base)边缘部位。 4.我们将罗氏沼虾精子上的一种能够被MRPINK特异性抑制的类明胶酶命名为罗氏沼虾精子明胶酶(MSG,M.rosenbergii sperm gelatinase)。应用HPLC(reversed-phase high performance liquid chromatography)和明胶-SDS-PAGE分析,MSG被分离纯化。通过氨基末端氨基酸测序分析和分子克隆,MSG的cDNA序列被揭示。Northern blotting结果表明,MSG在罗氏沼虾雄性生殖道中特异性地表达。原位杂交(ISH)实验进一步表明,MSG在罗氏沼虾的输精管和壶腹上皮分泌型细胞中表达。 结果表明,MRPINK竞争性地抑制chymotrypsin,其中domain2是具有抑制功能的结构域,而P_1 Pro对抑制作用的发挥具有重要作用。同时我们的实验还表明,MRPINK通过抑制精子上的类明胶酶(MSG)影响精子的活性,由此推测其可能对罗氏沼虾的受精具有调节功能。


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