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微流控芯片Edman降解及在蛋白质测序中的应用研究

陈文章  
【摘要】: 蛋白质的一级结构,即蛋白质内氨基酸的排列顺序是蛋白质科学研究的前提,获得该信息是一直是生命科学最重要研究内容之一,具有相当重要的意义。然而当前蛋白质序列测定的质谱法和Edman降解法都存在着不足之处。前者的局限在于准确度不高,会产生错误、假阳性的结果;后者灵敏度过低,需要样品量多,难于应用于同疾病相关的低丰度蛋白质序列测定。本文首次研究在微流控芯片内完成Edman降解,大幅度提高了Edman降解法测序的灵敏度,并且通过同MS技术联用,提高痕量蛋白质序列鉴定的准确度。 第一章综述了蛋白质一级序列测定进展。 第二章研制了体积仅为3.5 nL、可以重复使用的微流控芯片C18固相微萃取装置,研究了在微流控芯片上精确控制纳升级流体的方法。该C18柱可以富集痕量的多肽样品。二维凝胶电泳分离后的蛋白质酶解液通过固相微萃取脱盐后,样品体积由几微升浓缩到50 nL并直接转移至MALDI-TOF-MS靶上进行测定。分析结果表明新的方法能够大幅度蛋白质测定的序列覆盖度。 第三章研究了在微流控芯片用Edman降解测定蛋白质序列的方法和性能,并通过分子量的差别鉴定多肽的序列。采用该方法测定了亚飞摩尔级别合成多肽的序列,比经典的Edman降解法的样品用量降低了数百倍。与MALDI-TOF-MS相结合测定二维凝胶电泳分离后银染蛋白质样品序列时,原先模棱两可的结果有了明确的归属。 第四章通过在微流控芯片上进行一个循环的Edman降解,准确地得到多肽N端氨基酸残基的信息,解决了MS/MS谱图内难以辨别b/y系列离子的难题,并成功地完成了三个多肽样品(包括一个C端修饰的神经多肽)的从头测序。通过两个循环的Edman降解能够得到多肽的N端两个氨基酸残基的序列,根据这些信息能够推断出原始多肽MS/MS谱图中b_2离子的摩尔质量。采用b_2离子作为内标,可以提高测定MS/MS谱图中其它碎片质荷比的准确度,从而解决了在MS/MS测定时难以用内标法提高测定碎片离子摩尔质量准确度的问题。 第五章旨在提高Edman测序的自动化程度。研究了用注射泵输送气体试剂进行气相Edman降解的方法,用毛细管力将纳升级的液体试剂吸入微流控芯片,并用氮气压力将纳升级的液体试剂定量传输到固定了多肽样品的C18反应柱,实现了飞摩尔级Edman测序操作的初步自动化。


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