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《浙江大学》 2009年
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C末端肽段在RON/RON△160所介导的信号传导及致瘤活性中的作用

陆意  
【摘要】: 背景: 受体酪氨酸激酶RON在上皮细胞的生长、分化、增殖等过程中发挥着一定的作用。RON在乳腺,结肠,肺,甲状腺,皮肤,膀胱和胰腺肿瘤等组织中呈高度表达,而在正常上皮组织中呈低表达或不表达。RON的异常表达常伴随变异体产生。变异体RON△160的过度表达是结肠癌细胞的一个特征。RON含有多个功能性的结构域,如胞外的SEMA结构域、PSI基团、IPT单位和胞内的邻膜区、激酶区和C-末端磷酸化位点等。不同的结构域在RON介导的生物学活性中发挥着不同的作用。缺失或截断都会导致RON受体磷酸化活性改变。变异体RON△160缺失胞外段第一个IPT单位,使它具有致瘤性。C-末端位于RON第20外显子,在调节RON活性中发挥两个作用。一方面,其包含一个多功能结合位点—Y~(1353)VQL-PAT-Y~(1360)序列。该位点能招募下游的信号分子,如PI-3K,Smad,Grb2,STAT3等。当RON与特异性配体结合后,该位点的酪氨酸残基发生磷酸化、传导信号。但是包含两个突变位点Y~(1353)和Y~(1360)的突变体RON~(M1254T)显示这个多功能位点对致瘤活性不是必需的。另一方面,体外实验显示整个C-末端对RON激酶活性有自我抑制作用,主要通过是C-末端Tyr1353/1360残基与激酶区Tyr1238/1239残基之间的结合起作用。研究发现C-末端的Tyr1353/1360残基发生突变或被Phe替代后,C-末端与激酶区的结合更加紧密,进一步抑制RON活性。因此,C末端在RON介导的生物学活性中的作用有待于进一步研究。 目的: 本课题旨在研究RON蛋白在正常人消化道上皮组织及其癌变细胞中的表达状态,同时着重探讨RON-C末端肽段在RON及其变异体RON160所介导的信号传导及致瘤活性中的作用。 材料与方法: 采用单克隆抗体杂交瘤技术,制备并鉴定数个具有生物学活性的特异性抗RON单克隆抗体。通过免疫组织化学的方法,用抗RON单抗(2F2),检测了RON在正常人消化道及癌症组织中的表达。所用的组织芯片类型包括:正常成人、胚胎及多种消化道肿瘤组织。利用PCR方法构建了C末端缺失的两个RON变异体——RON-CF和RON△160-CF。通过细胞表达、蛋白化学分析、生物学功能及动物体内实验等实验方法,研究了C末端在RON及RON△160在促进细胞侵袭性生长中的一些作用及机理。 结果: 1、成功制备了特异性抗RON单克隆抗体Zt/g4、2F2和2C6,初步鉴定了它们在免疫组化、ELISA、免疫沉淀、免疫荧光等方面的性状。其中Zt/g4和2F2主要识别RON胞外段,两者都具有激活RON磷酸化的活性。2C6主要识别胞内段,没有明显抑制或激活RON的生物学活性;2、组织芯片的免疫组化结果显示,RON在消化系统的胚胎和成人组织中几乎不表达或呈低水平表达,两者的表达和分布没有明显差异;在食道癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌组织中,RON蛋白呈异常表达,其中50%以上的结直肠癌组织中RON为过度表达:3、C末端缺失的RON蛋白呈现明显的生化及生物学功能的异常,主要表现为:1) C末端缺失后导致RON受体无法发生二聚体化,蛋白磷酸化的作用消失;2)在RON介导的信号通路中,C末端缺失后RON/RON△160的自体磷酸化功能丧失、下游信号蛋白(Erk1/2、AKT)的磷酸化也抑制,RON△160介导的细胞浆内β-catenin的积聚的功能减弱;3)C末端去除后导致RON△160介导的细胞增殖、形态改变、迁移和动物体内致瘤效应等活性明显丧失。 结论: RON蛋白在正常人胚胎和成人消化道上皮组织中呈微量表达状态,而在部分消化道肿瘤组织,特别是在大肠癌中呈过度表达,提示RON的过表达可能和大肠癌的发生和进展有一定的病理联系。RON蛋白C末端是调节RON生物学功能的重要结构组成部分,通过影响RON受体的磷酸化,调节胞内信号蛋白途经的激活,从而调节细胞的生物学功能。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R730.2

【参考文献】
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