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《浙江大学》 2009年
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上皮性卵巢癌细胞诱导树突状细胞前体细胞亚群分化异常的研究

陈丽莉  
【摘要】: 前言 上皮性卵巢癌(epithelial ovarian carcinoma,EOC)是女性第五大致命的肿瘤。EOC病变的发展特点以局部浸润和直接播散为主,早期阶段也能出现盆、腹腔的转移,因此目前很多研究认为EOC的临床特点与局部肿瘤微环境免疫缺陷具有密切的相关性。 肿瘤微环境是指肿瘤局部由肿瘤细胞、细胞外基质与机体免疫系统之间相互作用所形成的免疫网络,目前对肿瘤微环境的研究主要集中在众多的细胞因子,树突状细胞(dendritic cell,DC)、T细胞、及NK细胞等,并认为这些细胞因子和细胞在肿瘤免疫耐受中起重要作用。 很多研究表明,肿瘤微环境中通常可见Th1/Th2/Th3类细胞因子表达失平衡,在抑制细胞介导的特异性抗肿瘤免疫反应中起到重要作用。而这种失衡主要表现为免疫抑制性Th2类细胞因子表达异常升高。但目前对升高的Th2类细胞因子的来源尚未完全清楚,对是否由EOC细胞异常分泌所致的直接证据仍有争议。90%以上的EOC起源于正常卵巢上皮(ovarian surface epithelium,OSE)。与OSE的功能相关,它们也能够产生各种细胞因子,但对来源于OSE的EOC细胞与OSE所产生的细胞因子是否存在差异所知甚少。 DC是肿瘤微环境中最重要免疫细胞之一。很多研究表明,DC系统的缺陷是肿瘤逃逸的主要因素,这些缺陷能通过不同的途径引起肿瘤微环境中T细胞的缺陷。DC是生物体内功能最强大的专职抗原提呈细胞,DC具有多种分类,其中最为常见的是分为髓样DC(myeloid dendritic cells,mDC)和浆细胞样DC(plasmacytoid dendritic cell,pDC)。前者诱导免疫反应,后者诱导免疫耐受。在肿瘤微环境中DC功能缺陷表现为成熟功能的DC数量下降,未成熟DC的聚集,以及具有免疫抑制功能的pDC增多。但是目前对肿瘤患者体内mDC的减少和pDC的增多机制并未明确。已有实验提供的直接或间接证据表明,在肿瘤微环境中肿瘤细胞及其产生的细胞因子能调节DC的分化、成熟和激活。但对EOC细胞是否也有此类作用尚不清楚,由EOC细胞产生的Th2类因子是否也参与这一过程尚有待阐明。因此,了解EOC细胞表达细胞因子的特征对明确卵巢癌患者体内异常升高的Th2类细胞因子的来源,并探究其对DC分化成熟及功能的影响,对阐明卵巢癌微环境免疫缺陷形成机制有极其重要的意义。 本研究首先应用细胞因子芯片技术检测并临床验证EOC细胞和OSE细胞表达细胞因子的差异;再通过体外建立的DC细胞分化培养模型,探究EOC培养上清对CD34~+造血干细胞来源的DC前体细胞分化的影响;最后经抗体中和实验观察卵巢癌细胞产生的细胞因子在卵巢癌细胞影响DC前体细胞分化中的作用,旨在阐明EOC细胞及其产生的细胞因子诱导卵巢癌微环境免疫缺陷的机制,为完善针对EOC的DC疫苗的研发提供实验依据。 第一部分上皮性卵巢癌细胞与正常卵巢上皮细胞细胞因子表达差异的研究 目的: 检测并验证EOC细胞与OSE细胞之间细胞因子表达的差异。 材料与方法: 采用细胞因子抗体芯片技术检测两种EOC细胞株(SKOV3和CaoV3)、原代培养的EOC细胞和原代培养的OSE细胞之间的细胞因子表达差异。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测EOC患者腹水、血清和良性妇科肿瘤患者腹腔液、血清中LIF、IL-10、IL-4和TGF-β1的表达。 结果: 细胞因子芯片检测结果发现,EOC细胞培养上清中表达水平超过OSE培养上清(2倍以上)的有LIF、IL-10和IL-4。LIF和IL-10在EOC患者腹水中的水平较良性妇科肿瘤患者腹腔液显著升高(P=0.02,P=0.001),但未在任一腹水或血清样本中检测到IL-4表达,EOC和良性妇科肿瘤患者的TGF-β1表达无显著差异。 结论: 上皮性卵巢癌细胞产生更多的免疫抑制性细胞因子LIF、IL-10和IL-4,从而导致部分细胞因子在患者体内水平增高。 第二部分上皮性卵巢癌细胞影响DC前体细胞分化的体外研究 目的: 证实上皮性卵巢癌细胞在体外能引起DC前体细胞异常分化,并导致成熟DC功能缺陷。 材料与方法: 用FLT-3L和SCF扩增来自CD34~+造血干/祖细胞的DC前体细胞。用GM-CSF和TNF-α培养诱导成熟的DC。在培养过程中加入EOC细胞株SKOV3培养上清,以研究其对于Lin~-CD45RA~-DC前体细胞分化和成熟的影响。流式细胞检测用以分析DC细胞的分群和表面分子标记。同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)增殖测定用以检测DC的刺激活性。用ELISA检测IL-12的分泌。 结果: Lin-CD45RA~-DC前体细胞在GM-CSF和TNF-α的培养下产生两群DC细胞:HLA-DR~+CD11C~+CD123~-髓样DCs(mDCs)和HLA-DR~+CD11C~-CD123~+浆细胞样DCs(pDCs)。与单纯的培养基及OSE培养上清相比较,在SKOV3培养上清的作用下,mDC的数量下降,而pDC的数量增加。不论有无SKOV3培养上清,DC细胞成熟标记HLA-DR和CD80的表达无显著差异。但是在SKOV3培养上清的作用下,DC的对于CD3~+T细胞的增殖刺激能力及分泌IL-12的能力均显著下降。 结论: 上皮性卵巢癌细胞抑制Lin~-CD45RA~-DC前体细胞向mDC分化成熟、促进向pDC分化成熟,同时使成熟DC的免疫活性受损。 第三部分细胞因子在卵巢癌细胞影响DC前体细胞分化和功能中的作用 目的: 探明卵巢癌细胞产生的细胞因子在卵巢癌细胞影响DC前体细胞分化和功能过程中所起的作用。 材料与方法: 用FLT-3L和SCF扩增来自CD34+造血干/祖细胞的DC前体细胞,用GM-CSF和TNF-α培养诱导成熟的DC。在培养过程中设置空白组,加SKOV3上清组,加SKOV3上清的同时加入抗IL-10和抗LIF抗体组,及空白组中加入细胞因子IL-10和LIF组合组。研究细胞因子对Lin~-CD45RA~-DC前体细胞分化和成熟的影响。流式细胞检测用以分析DC细胞的分群和表面分子标记。同种异体混合淋巴细胞反应测定用以检测DC的刺激活性。用ELISA检测IL-12的分泌。 结果: 在空白组培养基中加入IL-10+LIF,DC表达的HLA-DR和CD80较其余组别显著下降,且能够降低培养系统中mDC的比例,增高pDC的比例,并降低对CD3~+T细胞的增殖刺激能力及IL-12的分泌。而在SKOV3培养上清中加入抗IL-10+LIF细胞因子抗体,不能逆转SKOV3上清所致的DC前体细胞异常分化及刺激T细胞增殖能力降低的作用。 结论: 1、细胞因子IL-10+LIF能抑制Lin~-CD45RA~-DC前体细胞向mDC分化、促进向pDC分化,但细胞成熟度下降。 2、细胞因子抗体不能阻断上皮性卵巢癌细胞培养上清对DC前体细胞分化的影响,提示卵巢癌细胞可能通过多途径影响DC前体细胞分化。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R737.31

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【共引文献】
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