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《浙江大学》 2009年
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蔺草再生与转化体系的建立及其离体诱变种质的创新

许玲  
【摘要】: 蔺草是一种重要的经济作物,但是到目前为止还没有关于该植物种子诱导愈伤组织、愈伤扩繁及其植株再生方面的报道。鉴于蔺草植物的重要性,通过转基因和离体诱变获得遗传变异和品质改良的蔺草新种质资源。进行这些研究的第一步就是要建立一个高效的组织培养体系。 我们主要研究不同植物生长调节剂的组合以及培养基更新对5种蔺草品种植株再生的影响。在MS培养基中添加6-卞基腺嘌呤(BA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)对愈伤扩繁、植株再生和植株扩繁具有明显的促进作用。在鄞蔺1号、农林4号、岗山、太草和台湾绿草中,添加0.5 mg L~(-1)BA后,最高的愈伤诱导率分别达到80.95、90.48、75.40、70.83和83.33%。不同激素组合和连续接种(培养基更新)对胚性愈伤诱导和植株再生至关重要。实验结果表明MS培养基中添加0.1 mg L~(-1)BA和2 mg L~(-1)2,4-D对所有品种的蔺草愈伤扩繁最好。植株再生需要分两步,主要是进行培养基的更新和激素的平衡。通过把胚性愈伤组织从再生培养基Ⅰ[MS+0.5 mg L~(-1)BA+1.0 mg L~(-1)KT]转移到再生培养基Ⅱ[MS+0.5 mg L~(-1)BA+1.0 mg L~(-1)KT+3.0 mg~(-1)IAA]后得到超过70%以上的再生植株。研究结果证实了生长素(IAA)与细胞分裂素(BA和KT)比例的重要性。在植株扩繁实验中,1/2 MS培养基中添加0.5 mg L~(-1)BA后,农林4号和太草分别得到最高的植株存活率和扩增倍数(90.97%和5.40,94.23%和8.25)。建立的高效蔺草植株再生体系可进一步进行蔺草的遗传转化和离体诱变等研究。 基于建立的高效蔺草植株再生体系,进一步研究建立农杆菌介导蔺草的高效转化体系。农杆菌菌株EHA105内含有pKUB质粒带有cryIA(b),hph和gus基因,后两者为筛选标记基因,分别编码潮霉素磷酸转移酶基因和β-葡萄糖苷酸酶基因。研究结果表明150λM的乙酰丁香酮在诱导和共培养实验中均显著地增加愈伤的GUS~+率,当菌液浓度OD_(600)达到0.4时使愈伤GUS~+显著提高。侵染时间为45-60分钟,共培养时间为4天,侵染时间为第12或1 6天,这样的组合对遗传转化最有利,达到最高效率有9.56%。用GUS瞬间表达和潮霉素抗性来筛选阳性转化体,这一转化体系可以用来通过转基因的方法得到目标性状的植株,即通过种子得到胚性愈伤,在愈伤阶段通过农杆菌介导等方法将目的基因转入,然后得到转基因的再生植株。通过这一再生体系再经过转化条件的优化,初步建立了农杆菌介导转Bt基因的遗传转化体系。 基于蔺草生态和经济上的重要性,对主栽品种鄞蔺1号进行离体诱变处理,来研究甲基磺酸乙酯(EMS,0.1-1.0%处理6、12和24小时)和紫外线-C(UV-C,处理15、30、45和60分钟)对蔺草生理特征和超微结构的影响。将蔺草植株茎杆基部切取做离体诱变实验,经过EMS和UV-C处理后,将基段首先转移到1/2 MS培养基中,再转移到营养土和珍珠岩混合的盆钵中生长和繁殖。植株的生长势和生物量随着诱变剂浓度的升高而显著降低;在低诱变剂浓度时增加处理时间抗氧化酶活性明显增加,但是,在高处理浓度时,酶活性呈现下降的趋势。生理和超微结构在突变体茎杆中也发生了明显变化,尤其是叶绿素含量明显降低。突变体的细胞和叶绿体大小均有所降低,而且在叶绿体中出现了大量的脂滴,类囊体膜结构发生了明显的瓦解。EMS和UV-C处理后得到的在形态和超微结构上有所改变的突变体为该作物创造了遗传多样性,一些具有形态和生理上新颖性状的突变体被筛选用于植物育种中,并可进一步用于遗传研究。 对当地主要的蔺草栽培品种农林4号用抗有丝分裂的秋水仙碱离体诱变处理,得到四倍体植株。植株茎杆基部在离体条件下用秋水仙碱(0、50、100和500 mg L~(-1))分别处理6、12和24小时,然后将其转移到1/2 MS培养基中,再转移到营养土和珍珠岩混合的盆钵中生长和繁殖。再生植株用流式细胞仪确定其倍性。四倍体植株在形态上比二倍体粗壮,生物量也多。进一步研究秋水仙碱对植物细胞和亚细胞水平上的作用,根据解剖和超微结构的分析可以看出四倍体植株在细胞和亚细胞水平上与对照间的差异。从叶片表皮细胞可以看出四倍体气孔明显加大,但是气孔密度显著降低。而且,四倍体叶肉细胞更加紧凑,细胞间隙小,但是维管束尺寸明显加大。有趣的是,四倍体叶绿素含量明显降低,这可能是类囊体降解的结果。从亚细胞的超微图研究可以看出,高浓度的秋水仙碱对叶绿体有破坏作用,导致类囊体膜系统瓦解。这些蔺草四倍体植株可以用来进一步的遗传研究。 目前研究中,由EMS和UV-C诱变后蔺草DNA的损伤情况可以通过单细胞凝胶电泳的方法来进行评价(SCGE)。SCGE也叫作彗星检测,是一种能够在单细胞水平下检测DNA断裂损伤程度的方法。结果表明彗星率、慧头DNA含量、慧尾DNA含量与对照有显著差异(P<0.01)。实验可以看出,随着诱变剂量的增加DNA损伤率也明显增加。据我们所知,这是第一个用单细胞凝胶电泳的方法对蔺草离体诱变后DNA损伤情况作出的评价。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S564.4

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【引证文献】
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