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《浙江大学》 2010年
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Pseudomonas sp. M亚磷酸脱氢酶基因的克隆、表达和酶性质的研究

杜怡青  
【摘要】: 亚磷酸脱氢酶参与生物体中亚磷酸的代谢,催化亚磷酸氧化成磷酸的同时将NAD(P)~+还原为NAD(P)H。在常见的各种辅酶再生系统中,亚磷酸脱氢酶具有低K_m值、基本无逆反应、产物磷酸高浓度下不抑制反应、较宽的pH稳定性等优点,这些特性决定其在工业生物催化的辅酶再生过程中具有较高的应用价值和广阔的应用前景。 本论文从已报道的亚磷酸脱氢酶同源序列入手,以实验室保藏的若干细菌为靶标,通过分子生物学方法从Pseudomonas sp.M菌株中克隆到亚磷酸脱氢酶基因,构建亚磷酸脱氢酶基因重组表达质粒,通过诱导表达和亲和层析纯化,获得重组亚磷酸脱氢酶,进而研究了该亚磷酸脱氢酶的性质。 该亚磷酸脱氢酶基因由1011bp个核苷酸组成,编码336个氨基酸残基序列。分析基因的上下游序列发现,上游基因为ptxC基因,下游基因为ptxE基因,这说明该亚磷酸脱氢酶基因位于和Pseudomonas stutzeri WM88同源的ptxABCDE操纵子中。 将重组亚磷酸脱氢酶通过Ni-NTA亲和层析纯化,获得了高纯度的酶液。纯化后的亚磷酸脱氢酶在SDS-PAGE中显示为单一的条带。通过与标准蛋白的比较计算,测定重组酶的分子量为35kDa。 系统研究了重组亚磷酸脱氢酶的各项性质,包括最适反应温度、最适反应pH、热稳定性、pH稳定性和稳态动力学研究。结果发现:重组酶的最适反应温度为40℃,在pH 7.0的MOPS缓冲液中不同温度处理30min后,测定残余酶活力,结果发现重组酶在40℃以下稳定;重组酶的最适pH值为7.0,在不同pH条件下25℃处理1h后测定残余酶活,结果发现该酶在pH 7.0处最稳定;重组酶对亚磷酸钠的K_m和K_(cat)分别是0.633±0.036 mM和2.057±0.018 s~(-1),对NAD的K_m和K_(cat)分别是0.171±0.013 mM和2.789±0.029 s~(-1)。 这些研究为工业生产提供了可靠的数据支撑,为进一步深入研究酶的催化机理及酶蛋白三维结构研究奠定基础。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:Q78

【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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【二级参考文献】
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>谭静 >马瑞
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