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新型生物农药米多霉素类化合物的生物合成和活性评价

叶丹  
【摘要】:米多霉素(mildiomycin, MIL)是从放线菌Streptoverticillium rimofaciens的培养液中分离到的一种核苷类次级代谢产物,对多种植物的白粉病具有显著防治作用。本文研究目的在于通过在培养过程中添加米多霉素的理论前体:羟甲基胞嘧啶的结构类似物,利用微生物自身的合成代谢体系合成多种米多霉素的结构类似物,以获得活性更高的生物农药。对其中两种衍生物:米多霉素胞嘧啶衍生物(MIL-C)和米多霉素5-氟胞嘧啶衍生物(MIL-F),开展了发酵条件和分离工艺优化,并进行了分子结构鉴定、生物活性和毒性评价。 1.在Streptoverticillium rimofaciens的培养过程中添加5-氟胞嘧啶后,获得了米多霉素5-氟胞嘧啶衍生物(MIL-F)。通过对发酵条件优化,使MIL-F产量提高到了0.6g/l。对从发酵液分离提取MIL-F工艺进行了研究,获得了纯度超过95%的MIL-F产品。采用红外光谱、核磁共振及质谱分析等方法证明了所获得的MIL-F产物的分子结构确实是氟原子取代了MIL中胞嘧啶环上的羟甲基。考察了MIL-F的生物活性及毒理学性质,确定了MIL-F是一种高效、低毒、无刺激的生物农药。 2.在Streptoverticillium rimofaciens的培养基中添加胞嘧啶后,获得了米多霉素胞嘧啶衍生物(MIL-C)。考察了MIL-C发酵条件,发现适当控制胞嘧啶加入量可以抑制米多霉素合成,使MIL-C成为唯一产物;通过单因素实验、Plackett-Burman实验和响应面中心组合实验使MIL-C的产量达到1336.5 mg/l,比优化前产量提高了3.6倍。在详细研究了MIL-C在DK110弱酸性阳离子交换树脂上的离子交换特性的基础上,通过优化离子交换条件分离得到了纯度约70%的MIL-C粗产品。经树脂吸附脱色和CM650离子交换凝胶柱精制,使MIL-C纯度达到了95%以上。采用全波段扫描、核磁共振及质谱分析等方法证明了所获得的MIL-F产物的分子结构确实是氢原子取代了MIL中胞嘧啶环上的羟甲基。 3.考察了MIL-C的体内、体外生物活性,并开展了一年两地的田间小区实验。实验结果表明MIL-C制剂对南瓜白粉病和黄瓜白粉病都具有显著防效,药力控制良好。MIL-C对南瓜和黄瓜安全,对花和果实生长均无不利影响,对周围环境友好。对MIL-C进行安全性评价确定MIL-C是一种低毒、无刺激的农用抗生素。 4.结合chemoffce组件对MIL、MIL-C和MIL-F参数进行分析比较,可以初步推断MIL的主要药效基团是可能是精氨酸上的胍基,该结构如果被破坏会导致MIL失活。 通过本论文的研究,获得了两种米多霉素的结构类似物:MIL-F和MIL-C;经发酵工艺优化,大幅度提高了它们的产量;对生物活性的测试结果表明,它们对白粉病的防治效果都高于米多霉素,有可能成为高效、低毒的新型农药。对米多霉素及其类似物结构-功能关系的研究为将来发现新农药打下了良好的基础。


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