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《浙江大学》 2009年
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FOXO3a基因在Anoikis中对细胞的保护作用研究

陈昊  
【摘要】: 目的:探索FOXO3a基因对Anoikis的影响。 方法:自行设计FOXO3a基因的shRNA,构建插入shRNA的LMP逆转录病毒质粒,经过克隆选择后,在phoenix细胞中包装病毒,使用病毒转导shRNA-FOXO3a进入MCF10a,MCF7和MDA-MB-231细胞,经过puromycine选择后建立FOXO3a表达沉默细胞系;使用血清饥饿法诱导FOXO3a的表达,建立了FOXO3a高表达细胞系。利用polyhema迫使细胞处于suspension状态模拟细胞离开细胞外基质的条件,通过测定caspase-3,Annexin V/PI,DNA ladder和Trypanblue staining判断早期,中、晚期细胞凋亡的状态以及死亡细胞的数量。测定细胞内ROS(ReactiveOxygen Species)的水平判断细胞从attachment到suspension ROS的变化,通过补充小剂量的ROS和使用ROS的抑制剂NAC观察细胞凋亡和死亡的状态,使用GSA(Gel Shift Assay)检测FOXO3a是否作为转录因子与MnSOD启动子中的结合域结合调控MnSOD的表达,通过western blot判断MnSOD的表达变化。使用IP(immune-Precipitation)法检测FOXO3a蛋白是否与E-cadherin蛋白相互作用而影响细胞的生存状态,western blot判断E-cadherin的表达。 结果:使用shRNA和血清饥饿法成功的构建了FOXO3a低表达和高表达细胞系。细胞凋亡和死亡的检测结果显示相对于attachment细胞,suspension细胞的凋亡比率和死亡数量明显升高;attachment细胞之间没有显著差异;suspension细胞中,FOXO3a基因沉默细胞凋亡比率和死亡数量明显升高;在血清饥饿诱导FOXO3a表达的suspension细胞中,凋亡指标降低。在MCF10a细胞中,相对于attachment细胞,ROS的水平在suspension细胞中明显下降,在FOXO3a基因沉默的细胞中ROS的含量明显低于对照组,当给予小剂量的ROS,明显改善了suspension细胞的存活,而NAC作为ROS的抑制剂逆转了该现象。GSA结果显示FOXO3a作为转录因子可以与MnSOD启动子结合调控MnSOD的表达,与attachment状态相比,在suspension条件下,MnSOD的表达升高,在FOXO3a基因沉默的细胞中相升高更明显。IP实验证实FOXO3a蛋白可用E-cadherin因子相互作用,E-cadherin的表达在attachment细胞中无明显差异,在suspension细胞中,FOXO3a基因沉默的细胞E-cadherin表达降低。 结论:FOXO3a通过调控MnSOD影响ROS以及与E-cadherin相互反应授予细胞Anoikis抵抗的能力。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R363

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