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《浙江大学》 2009年
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小窝蛋白-1在高糖诱导的人晶状体上皮细胞凋亡调控中的作用

张志勇  
【摘要】: [目的]小窝蛋白-1(caveolin-1)参与了上皮细胞(epithelium)凋亡的调控过程,而既往的研究证实晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs)凋亡在早期的糖尿病性白内障发病过程中发挥重要的作用。本研究的第一部分,通过高糖干预LECs,观察细胞的凋亡率变化和小窝(caveolae)的分布,Caveolin-1的mRNA水平及蛋白表达变化情况,探讨Caveolin-1与高浓度葡萄糖干预的LECs凋亡之间的关系,以明确Caveolin-1在高糖诱导的LECs凋亡调控中发挥的作用。本研究第二部分,通过研究表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和辛伐他汀(simvastatin)对高糖干预的LECs的细胞凋亡率和Caveolin-1表达的影响,进一步阐明Caveolin-1与高糖干预的LECs凋亡之间的相关性,为将来研究Caveolin-1与糖尿病性白内障之间的关系,以及糖尿病性白内障的防治奠定基础。 [方法]根据文献报道的LECs高糖干预模型,将葡萄糖溶液(5-25 mM),或将作为渗透压对照的甘露醇(20 mM)和葡萄糖(5 mM)的混合溶液加入DMEM培养液,并用该培养液处理人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLECs)的B3系细胞株。收集经过1-48h培养的细胞,使用流式细胞仪检测细胞凋亡率、实时定量RT-PCR测定Caveolin-1的mRNA表达、Western blot法分析Caveolin-1蛋白水平、免疫荧光细胞化学法观察Caveolin-1和磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)的表达、透射电镜观察Caveolae的分布。此外,进一步将EGF(0.1 ng/ml)或辛伐他汀(10 nM)和葡萄糖(5或25mM)一起加入DMEM培养液,处理细胞48h,同样使用流式细胞仪检测细胞凋亡率,并用实时定量RT-PCR和Westem blot法评价Caveolin-1的表达水平。 [结果]1.不同浓度的葡萄糖干预,对HLECs凋亡率及Caveolin-1的mRNA表达的影响。 经过5、10、15、20、25mM葡萄糖培养液的48h培养,HLECs的凋亡率随糖的干预浓度增加而明显增加(p<0.05),而Caveolin-1的mRNA表达水平则明显减少(p<0.01)。其中,25mM葡萄糖干预组HLECs的凋亡率最高,Caveolin-1的mRNA表达水平最低。渗透压对照组的HLECs凋亡率、Caveolin-1的mRNA表达水平与5mM葡萄糖干预组无显著差异(p>0.05)。 2.不同时间的高糖干预,对HLECs凋亡率及Caveolin-1的mRNA表达的影响。 进一步对高糖(25mM葡萄糖)干预下,HLECs的凋亡率和Caveolin-1的mRNA表达水平与干预时间的相关性进行研究,发现经过1-48h培养,对照组HLECs的凋亡率及Caveolin-1的mRNA表达水平无明显增加(p>0.05),而从12h开始,高糖干预组的HLECs的凋亡率随培养时间增加而明显增加(p<0.05),Caveolin-1的mRNA表达水平则明显下降(P<0.05)。 3.高糖对HLECs的Caveolin-1蛋白表达的影响。 此外,与我们检测到的Caveolin-1的mRNA表达的变化趋势类似,Western blot的结果显示,经48h的培养,HLECs的Caveolin-1蛋白表达随干预的糖浓度增加而明显减少(P<0.05),渗透压对照组则与5mM对照组蛋白表达相近(p>0.05)。而在高糖干预1-48h的时间相关性实验中,从24h开始,高糖干预组的HLECs随着培养时间的延长,Caveolin-1蛋白表达也逐渐减少(P<0.05)。 4.免疫荧光染色和透射电镜观察。 在免疫荧光细胞化学实验中,与对照组细胞相比,高糖干预组的Caveolin-1荧光染色强度明显下降,说明Caveolin-1蛋白表达下降。另外,从细胞膜的胞浆侧外翻到细胞膜外侧的PS染色阳性的细胞数明显增加,说明细胞的凋亡率增加。透射电子显微镜观察发现,高糖干预使HLECs的Caveolae分布明显减少。 5.辛伐他汀和EGF对高糖干预HLECs凋亡率及Caveolin-1表达的影响。 辛伐他汀和EGF可以明显增加高糖干预组的Caveolin-1 mRNA的水平(p<0.01),同时使HLECs凋亡率明显降低(p<0.05)。辛伐他汀和EGF都可以使,高糖培养HLECs的Caveolin-1蛋白表达水平,明显增高到接近5mM葡萄糖对照组的水平。 [结论]1.本研究首次联合应用实时定量RT-PCR法、Western-blot法、免疫荧光细胞化学法和透射电镜法,对高糖培养的HLECs进行Caveolin-1表达和Caveolae的分布的分析,发现HLECs的Caveolin-1表达和Caveolae的分布明显受到环境中糖浓度的影响,高浓度的葡萄糖使Caveolin-1表达降低,Caveolae分布减少。研究结果提示,HLECs的Caveolin-1结构,参与了细胞对高糖刺激的反应过程。 2.本研究首次将Caveolin-1蛋白,引入了对高糖诱导的HLECs凋亡实验研究中,并发现高糖干预使HLECs的Caveolin-1表达下降,而细胞凋亡增加,两者存在相关性。这就明确了,Caveolin-1在高糖诱导HLECs凋亡过程中发挥作用,并可能参与凋亡的调控过程。这还为将来,进一步根据糖尿病引起的LECs凋亡可以导致糖尿病性白内障的既往研究结果,深入研究Caveolin-1与糖尿病性白内障形成的关系奠定基础。 3.本研究使用临床上常见的辛伐他汀和EGF两种药物干预高糖培养的HLECs,发现两者都使HLECs的Caveolin-1表达增加,而细胞凋亡率减少,并且细胞Caveolin-1表达和凋亡率都恢复到接近正常组的水平。说明HLECs在高糖干预情况下,Caveolin-1表达的变化与的LECs凋亡存在相关性。鉴于人为控制干预因素,来影响LECs凋亡过程,在防治糖尿病性白内障以及后发性白内障的发生发展中,所起的重要作用。本研究,为将来进一步深入研究Caveolin-1与糖尿病性白内障及后发性白内障的形成机制的关系及其防治,提供了思路。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R776.1

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