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《浙江大学》 2010年
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eIF2α磷酸化及ATF6参与苯并(a)芘-7,8-二氢二醇-9,10-环氧化物诱发的细胞应激反应

王巧玲  
【摘要】: 苯并(a)芘-7,8-二氢二醇-9,10-环氧环氧化物(benzo(a)pyrene-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide,BPDE)是多环芳烃类(polycyclicaromatic hydrocarbons,PAHs)环境化学污染物苯并(a)芘(BaP)在体内代谢活化后的终致癌物。BPDE可引起大块加成性DNA损伤,而细胞对BPDE的作用并不是一个被动接受的过程,细胞通过细胞周期“校正点”(checkpoint)、核苷酸切除修复、DNA跨损伤复制(translesion synthesis,TLS)、内质网应激等的激活以及基因表达的改变来抵抗BPDE造成的损伤。 我们实验室全基因组芯片实验结果显示BPDE诱导的基因表达改变与其引起细胞周期阻滞、细胞生长抑制以及细胞凋亡等表型密切关联。我们应用PromoterAnalysis Pipeline(PAP,http://bioinformatics.wustl.edu/webTools/PromotorSearch.do)在线启动子区转录因子结合位点分析软件,分析芯片结果中0.5μM BPDE处理下表达改变并经定量RT-PCR验证的上调基因。我们发现部分基因的调节与BPDE激活一些应激反应相关的转录因子和信号通路有关。这些转录因子包括AP-1家族转录因子(AP-1,c-FOS和ATF2:c-Jun二聚体)、CREB/ATF家族转录因子(CREB,ATF4,ATF6和ATF3)、NF-κB及其家族成员(p50,p65和c-REL)、Elk1、以及p53等。在这些预测可能被BPDE激活的转录因子中,部分转录因子的激活在以往的研究中已经被发现,但是CREB/ATF家族转录因子的激活尚未见报道。 为更加深入地了解细胞如何通过识别和处理BPDE引起的应激信号发挥效应,我们集中研究了BPDE暴露细胞中CREB/ATF家族转录因子ATF6和ATF4、以及在ATF4上游发挥重要作用的真核翻译启动因子2α亚单位(αunit of eukaryoticInitiation Factor 2,eIF2α)的表达、激活情况及其生物学意义。 eIF2α/ATF4信号通路在细胞识别和处理应激信号过程中发挥重要作用。目前发现哺乳动物细胞中存在四种eIF2α磷酸激酶,即HRI(haem-regulated inhibitorkinase)、PKR(protein kinase RNA-dependent)、PERK(PKR-like endoplasmic reticulum(ER)kinase)和GCN2(general control non-derepressible-2)。每种激酶具有自己独特的调节结构域,接受不同应激信号的调节。eIF2α在蛋白质翻译起始过程中发挥着重要的作用。eIF2α的磷酸化可以引起整体蛋白的翻译减少,从而减少应激状态下细胞承受的压力;同时,eIF2α磷酸化也会选择性地激活某些蛋白的翻译,如ATF4和ATF5等。ATF4表达上升又可以激活其他一些转录调节因子,如ATF3、CHOP(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein/GADD153(growth arrest andDNA-damage-inducible protein 153))等。这些转录因子可以激活一系列在调节细胞损伤修复和凋亡等过程中发挥重要作用的基因。ATF6(包括ATF6α和β)是内质网应激反应(ER stress)相关转录因子。它的激活依赖于其从内质网转运到高尔基体,并被位点1蛋白酶(S1P)和位点2蛋白酶(S2P)切割产生有活性的N端片段,进而促进分子伴侣和蛋白折叠酶的表达,发挥细胞保护作用。ATF6α和ATF6β的序列具有高度的同源性,并且在内质网应激时都可以被剪切。研究报道两者可能发挥着相似的作用,但也有研究报道ATF6β的转录活性较低,可能作为ATF6α的抑制因子存在,因此本文中对ATF6的研究主要集中在ATF6α上。 我们用不同浓度BPDE(0.05,0.5,1和2μM)处理人羊膜FL上皮细胞,经不同时间培养后,收集全细胞裂解液,采用聚丙烯凝胶电泳和免疫印迹法检测ATF4和ATF6α的表达、以及eIF2α磷酸化的改变情况。为观察BPDE引起eIF2α磷酸化的细胞效应,我们应用特异性eIF2α磷酸水解酶抑制剂salubrinal来延长BPDE引起的eIF2α磷酸化,采用DNA片段化分析和Hoechst染色、PI标记流式细胞仪分析以及CCK-8细胞活力检测试验来分别检测延长BPDE引起的eIF2α磷酸化后对BPDE诱导的细胞周期阻滞、细胞凋亡和细胞活力抑制的影响。结果表明,BPDE暴露可引起eIF2α磷酸化增强以及ATF4表达上调,并引起ATF6α全长蛋白减少,但未检测到在内质网应激中起作用的PERK以及其它已知eIF2α上游激酶的激活。BPDE处理可引起FL细胞S和G_2/M期阻滞、出现明显的细胞凋亡以及细胞活力下降,而延长eIF2α磷酸化的特异性eIF2α磷酸水解酶抑制剂salubrinal可逆转BPDE的这些细胞效应。说明eIF2α磷酸化在BPDE诱导的细胞凋亡和细胞周期阻滞等毒性作用中发挥一定的保护作用。ATF6α全长蛋白的减少提示了ATF6参与了BPDE引起的细胞应答反应,并且可能被裂解从而发挥细胞保护作用。 由此可见,BPDE作用于细胞一方面可导致细胞周期阻滞、凋亡以及细胞活力下降等细胞毒性效应;另一方面,BPDE又激活eIF2α以及ATF4和ATF6等CREB家族的应激相关转录因子从而发挥了一定的保护作用。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R363

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【参考文献】
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