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人APOBEC3G抑制乙型肝炎病毒复制的机制研究

赵冬久  
【摘要】: 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)是一种DNA病毒,能引起急性及慢性肝脏病变,每年有大约100万人死于HBV感染所致的肝功能衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。肝炎的转归是宿主免疫与HBV体内复制之间进行复杂的相互作用的最终结果,固有免疫是机体抵御病毒感染的第一道防线,发挥重要的抗病毒作用。 人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(Apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide 3 protein G,APOBEC3G)是被新发现的固有免疫分子中的一员,有广泛的抗病毒作用。APOBEC3G通过与Gag结合进入艾滋病病毒-1(HIV-1)的病毒颗粒中并在逆转录时使脱氧胞嘧啶脱氨变为脱氧尿嘧啶,从而抑制病毒复制;之后也发现APOBEC3G以非脱氨形式抑制病毒复制。病毒侵染因子(Vif)介导APOBEC3G蛋白泛素化及蛋白酶体降解,使得HIV-1对抗APOBEC3G介导的抗病毒作用。近来有研究者指出APOBEC3G能抑制HBV DNA复制及蛋白表达,但是目前对其抗HBV的作用机制还不是很清楚。 本研究组建立了APOBEC3G稳定表达细胞株,观察APOBEC3G抑制HBV复制过程中参与的信号通路及细胞因子;我们用荧光能量共振转移(FRET)技术及表面离子共振实验(SPR)检查APOBEC3G与HBV核心抗原(HBc)之间是否有结合,并且观察RNA对它们之间相互作用的关系的影响;同时我们构建APOBEC3G不同突变体,观察它们对HBV复制的抑制作用并研究它们与HBc的关系。因此本研究共分为三个部分。 第一部分NF-κB参与人APOBEC3G抗HBV过程之中 研究目的 证实APOBEC3G能抑制HBV DNA复制和蛋白表达,建立稳定过表达APOBEC3G的细胞株,观察是NF-κB否参与APOBEC3G抗病毒过程中,探讨APOBEC3G抗病毒机制。 研究方法 转染APOBEC3G到HepG2细胞以建立稳定过表达APOBEC3G的细胞株,用PCR及western验证细胞株是否构建成功,同时转染pcDNA3.1 (-)-myc-his作为对照;用RT-CES系统实时检测细胞的生长状态;转染pEGFPN-1到构建成功的细胞株中,用流式细胞仪及荧光显微镜检测过表达APOBEC3G是否影响细胞接受外来质粒的能力;转染1.3拷贝的HBV质粒,用荧光定量PCR检测细胞中HBVDNA水平,用放射免疫法检测上清中HBs Ag及HBe Ag的表达量的变化;将pNF-KB-Luc质粒单独或与1.3拷贝的HBV质粒共转染到构建成功的细胞后,检测荧光素酶活性;转染1.3拷贝的HBV质粒到构建成功的细胞后,用含有IKKP抑制剂(IMD-0354)的培养基培养转染,荧光定量PCR测HBV DNA水平的变化;设计引物,用相对荧光定量PCR检测成功构建的细胞株中IL-6、IL-8、IL-1β、IL-1α的水平。 研究结果 1.从RNA及蛋白水平证实稳定表达APOBEC3G的HepG2细胞株构建成功; 2.稳定过表达的APOBEC3G能抑制HBV DNA复制及HBs Ag及HBe Ag的表达; 3. APOBEC3G不影响HepG2细胞的生长,RT-CES系统实时检测发现过表达APOBEC3G的HepG2细胞的生长状态与对照没有差异; 4. APOBEC3G不影响HepG2细胞接受其他质粒,流式结果显示过表达APOBEC3G的HepG2细胞的pEGFPN-1的转染效率及荧光强度与对照组没有差异;用荧光显微镜观察得到同样结果; 5. APOBEC3G能激活NF-κB,如果伴随HBV的感染NF-κB更是被显著激活; 6.阻断NF-κB的激活能抑制APOBEC3G抗病毒作用,用含有IKKβ抑制剂(IMD-0354)的培养基培养过表达APOBEC3G细胞时,APOBEC3G对HBVDNA的抑制效率只有42%,不加IMD-0354时APOBEC3G对HBV DNA的抑制达到90%; 7. APOBEC3G能上调IL-6、IL-8及IL在HepG2细胞中的表达;但对IL-1α的表达没有影响; 研究结论 1. APOBEC3G能抑制HBV DNA复制及HBs Ag及HBe Ag的表达; 2. NF-κB参与APOBEC3G对HBV DNA的抑制过程中; 3. APOBEC3G可能通过激活NF-κB再诱导IL-6、IL-8、IL-1β等炎症因子从而抗病毒。 第二部分APOBEC3G能直接结合HBV核心抗原 研究目的 观察APOBEC3G与HBV核心抗原(HBc)之间的关系,了解它们是直接结合还是需要RNA或其他细胞成分的介导,探讨APOBEC3G抗HBV病毒的作用机制。 研究方法 构建pA3G-CFP及pHBc-YFP融合质粒,用激光扫描共聚焦显微镜观察pA3G-CFP和pHBc-YFP在HepG2细胞中的定位;共转染pA3G-CFP及pHBc-YFP到HepG2细胞中,用荧光共振能量转移(FRET)成像,再计算FR值,观察细胞中APOBEC3G是否能结合HBc;构建带有HA标签pA3G-HA及HBc聚集缺陷突变体pHBc-Y132A-HA,表达并纯化APOBEC3G及HBc-Y132A-HA蛋白,用BIAcore3000检测纯的APOBEC3G与HBc-Y132A-HA蛋白是否有相互作用,同时加入HepG2细胞RNA及HepG2.2.15细胞RNA看对它们的结合是否有影响。 研究结果 1.成功构建pA3G-CFP、pHBc-YFP、pA3G-HA及pHBc-Y132A-HA等质粒; 2.用激光扫描共聚焦显微镜观察到APOBEC3G散点状分布在胞浆中,而HBc则在胞浆胞核中均有分布,两个蛋白在胞浆中有共定位; 3.三通道FRET在FRET通道检测到APOBEC3G-CFP与HBc-YFP之间有FRET信号,FR值与阴性对照组相比有显著差异;同样荧光受体漂白实验也检测到APOBEC3G-CFP与HBc-YFP之间有FRET信号; 4.成功获得APOBEC3G-HA及HBc-Y132A-HA蛋白,BIAcore3000检测到APOBEC3G-HA与HBc-Y132A-HA之间有SPR信号; 5.加入HepG2细胞RNA及HepG2.2.15细胞RNA后,APOBEC3G-HA与HBc-Y132A-HA之间的SPR信号没有显著改变。 研究结论 1. APOBEC3G与HBc在HepG2细胞中有相互作用; 2. APOBEC3G能与HBc直接结合,而不依赖与细胞中的其他成分,细胞RNA及病毒RNA对他们的结合没有影响。 第三部分APOBEC3G不同结构域对HBV的抑制作用及机制研究 研究目标 研究APOBEC3G不同结构域对HBV DNA复制的影响,寻找APOBEC3G对HBV作用的功能域;寻找APOBEC3G与HBc的结合域。 研究方法 构建APOBEC3G功能域缺失体pCD1、pCD2和活性中心缺失体pDE12,将构建好的质粒分别与1.3拷贝HBV质粒共转到HepG2细胞中,用荧光定量PCR检测它们对HBV DNA的抑制效果;构建pCD1、pCD2、pDE12与CFP的融合质粒pCD1-CFP、pCD2-CFP、pDE12-CFP,将荧光蛋白融合质粒分别转入HepG2细胞中,激光扫描共聚焦显微镜观察CD1、CD2和DE12在细胞中的分布;将pCD1-CFP、pCD2-CFP、pDE12-CFP分别与pHBc-YFP共转到HepG2细胞中,用荧光受体漂白实验观察它们与HBc的关系。 研究结果 1.成功构建APOBEC3G功能域缺失体pCD1、pCD2及pDE12及pCD1-CFP、pCD2-CFP、pDE12-CFP; 2.用激光扫描共聚焦显微镜发现CD1分布在胞浆中,而CD2在胞浆胞核中都有表达,DE12则分布在核周的胞浆中,且CD1和DE12有聚集现象; 3.CD1和CD2均能显著抑制HBV DNA的复制,且CD2的抑制效果比全长APOBEC3G的抑制效果更显著,两个活性中心都去掉的DE12的抑制作用则相对较弱; 4.荧光受体漂白实验检测到CD1-CFP、CD2-CFP与HBc-YFP之间都有FRET信号,但是CD2-CFP与HBc-YFP之间的信号比CD1-CFP与HBc-YFP之间的信号弱,且都比全长APOBEC3G与HBc之间的信号弱,DE12-CFP与HBc-YFP之间没有检测到FRET信号。 研究结论 1. APOBEC3G的两个功能域都能抑制HBV的复制,这说明APOBEC3G的抑制机制不是单一的; 2. APOBEC3G的两个功能域都能与HBc结合,但是N端结构是主要结合域。 全文结论 1.APOBEC3G能显著抑制HBV DNA的复制及蛋白表达,且NF-κB可能参与APOBEC3G抗HBV过程之中; 2.APOBEC3G和HBV核心抗原具有相互作用,且不依赖其他细胞蛋白及RNA; 3.APOBEC3G的两个不同功能域APOBEC3G-CD1和APOBEC3G-CD2均有抑制HBV复制的作用,同时去掉后没有抑制功能,证明活性功能域是主要的作用结构,且说明APOBEC3G的抗病毒机制不是单一的。


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