小檗胺衍生物BBD24体内外抗骨肉瘤作用及其机制的研究
【摘要】：
骨肉瘤是儿童及青少年最常见的骨的原发性恶性肿瘤,其发生率为每百万人口中4至5例,各种族间无差异。目前临床治疗骨肉瘤的化疗药物仍以阿霉素(ADM)、顺铂(DDP)、和大剂量的甲氨蝶岭(MTX)为主,其他还有近年来应用的异环磷酰胺(IFO)等。虽然化疗明显改善骨肉瘤患者的预后,并且近年来骨肉瘤的治疗取得了一定进展。但近二十多年来骨肉瘤患者的5年生存率仍徘徊在60%上下。在过去的20年中,新的化疗药层出不穷,如肺癌在新药物的使用下疗效明显改善。但是少有发现抗骨肉瘤的新药。仅Navid F发现联合应用吉西他滨和紫杉萜治疗骨与软组织肉瘤转移患者,有良好的抗肿瘤作用及耐受性。因此,开发新的高效低毒的抗骨肉瘤药物或新的化疗增效药,是目前骨肉瘤治疗中的重要课题。
小檗胺(Berbamine)是从小檗属植物的根茎中提取的一种药物。近年来,研究发现小檗胺对肝癌细胞(SMMC7721).宫颈癌细胞(Hela).白血病细胞(K562和HL-60)等都有抑制增殖作用,但是小檗胺对骨肉瘤作用的研究还未见报道。为近一步提高抗肿瘤作用,通过结构修饰化学合成了新型小檗胺衍生物BBD24。因此,本论文以小檗胺衍生物BBD24为切入点,旨在研究小檗胺衍生物BBD24体内外抗骨肉瘤的作用及其机制。MTT实验结果表明,BBD24能显著抑制骨肉瘤细胞系MNNG/HOS和MG63的生长,并且呈剂量依赖性和时间依赖性。进一步研究了BBD24对骨肉瘤细胞增殖抑制的分子机制发现,可以诱导骨肉瘤细胞发生凋亡、坏死和自噬。为了明确小檗胺类化合物在细胞内的分布,我们应用生物素标记的小檗胺和免疫荧光技术对小檗胺在人MNNG/HOS骨肉瘤细胞内的分布进行动态示踪和观察后发现,随着作用时间的延长,小檗胺的分布逐渐向细胞核周边的胞浆集中,并且48小时在细胞核内也可见红色荧光,提示小檗胺有可能进入细胞核内,发挥抗肿瘤活性。进一步对增殖相关的多个信号通路的研究发现,BBD24下调人骨肉瘤MNNG/HOS细胞Wnt/p-catenin信号通路和NF-κB信号通路。对BBD24和临床常用的骨肉瘤化疗药物顺铂联合作用骨肉瘤细胞系MNNG/HOS发现,二者具有协同作用。
本实验收集了8例骨肉瘤患者原代标本,通过MTT测定后发现,小檗胺衍生物BBD24可以有效杀伤原代骨肉瘤细胞,且呈现明显的剂量依赖性,IC50基本在1.0-2.0μg／ml。我们同时收集了4例正常人外周血单个核细胞标本,BBD24对正常细胞的毒性实验提示IC50基本在8.0-10.0μg／ml,明显低于骨肉瘤患者原代细胞。
小檗胺衍生物BBD24对裸鼠骨肉瘤移植模型的作用实验,以3×106／0.2ml细胞浓度接种于背部肩胛附近皮下,造模成功率为100%,接种24h后开始给药,给药时间及剂量为小檗胺衍生物BBD24 10mg／kg,灌胃,一天两次,连续给药20天。结果显示,BBD24可以显著抑制MNNG/HOS移植瘤,且对BALB/c-nu/nu裸鼠没有任何可见的毒副反应。
本研究表明小檗胺衍生物BBD24具有显著地体内外抗骨肉瘤作用,提示其具有一定的临床应用价值和开发前景。
【关键词】：小檗胺衍生物 结构修饰 BBD24 骨肉瘤 细胞凋亡 细胞周期 协同作用 骨肉瘤移植模型 【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R738
【目录】：
- 致谢5-6
- 中文摘要6-8
- Abstract8-11
- 缩略语11-13
- 插图和附表清单13-16
- 目次16-18
- 正文18-82
- 1 绪论18-25
- 1.1 骨肉瘤治疗现状18-20
- 1.2 小檗胺20-22
- 1.3 肿瘤细胞中存在的多种死亡方式22-25
- 2 小檗胺衍生物BBD24对人骨肉瘤细胞系MG-63和MNNG/HOS增殖抑制作用及分子机制研究25-54
- 2.1 引言25
- 2.2 主要实验材料25-30
- 2.3 BBD24对于骨肉瘤细胞系MNNG/HOS和MG63生长的影响30-35
- 2.4 BBD24激活人骨肉瘤细胞株MNNG/HOS多条死亡途径35-40
- 2.5 小檗胺类化合物在人骨肉瘤细胞株MNNG/HOS中的分布40-43
- 2.6 BBD24对人骨肉瘤细胞株MNNG/HOS增殖相关的多个信号通路的影响43-46
- 2.7 小檗胺衍生物与顺铂协同作用的研究46-50
- 2.8 讨论与小结50-54
- 3 小檗胺衍生物BBD24对骨肉瘤患者原代肿瘤细胞增殖抑制作用的研究54-63
- 3.1 引言54
- 3.2 材料与方法54-56
- 3.3 结果56-62
- 3.4 讨论与小结62-63
- 4 小檗胺衍生物BBD24体内抗骨肉瘤效果的研究63-74
- 4.1 引言63-64
- 4.2 材料与方法64-66
- 4.3 结果66-71
- 4.4 讨论与小结71-74
- 5 结论74-75
- 参考文献75-82
- 综述一82-90
- 综述二90-111
- 作者简历及在学期间所取得的科研成果111-112
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