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《浙江大学》 2010年
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dsRNA介导的烟草和番茄抗病毒基因工程研究

胡琼  
【摘要】: 本研究以在植物体内转录出RNA沉默的高效诱导因子-dsRNA为目标,在已有的表达黄瓜花叶病毒(CMV)部分复制酶基因和烟草花叶病毒(TMV)部分移动蛋白基因的dsRNA的T0代转基因烟草基础上对其后续4代转基因烟草进行了抗病性及抗性机制分析。 挑选转CMV部分复制酶基因的转基因烟草T0代抗病株系和感病株系的种子,对其T1代幼苗进行Southern blot检测,结果发现不同抗性株系间的拷贝数均存在很大差别,且抗病性与拷贝数不存在相关性。对T1代幼苗的抗性测定发现,T0代为免疫型的植株在T1代时其抗病性发生分化,免疫型与感病型的比率约为1:1-3:1。T1代株系中挑选四个抗病株系和一个感病株系,通过自花授粉得到T1代种子,播种后的T2代幼苗在四叶期时摩擦接种CMV,结果显示抗病株系接种CMV后不发病,而感病株系和非转基因对照的发病率是100%,说明T2代转基因烟草免疫株系的抗病性是稳定的。对T2代烟草Southern blot检测表明,T2抗病株系Rep15-1-1,Rep15-1-61等为单拷贝株系。从自花授粉得到的免疫型T3代中选择了Rep15-1-1-15、Rep15-1-1-26、Rep15-30-23-27,对其T4代的抗性测定表明,转基因烟草中检测不到病毒。选择了抗性强且遗传性稳定的Rep15-1-1-15株系,接种病毒后测定其T4代各三株转基因烟草中的病毒RNA和siRNA,结果表明转基因烟草在接种前后均能检测到信号很微弱的CMV RNA,而非转基因烟草接种病毒后存在大量的CMV RNA;转基因烟草中均能检测到24 nts和21 nts两种类型的siRNA,且两种siRNA信号强度差别不大,而非转基因烟草在接种前后均检测不到siRNA.以上结果表明,转基因烟草的抗性是通过基因沉默降解病毒RNA而产生的。将转基因烟草T4代株系部分幼苗分别放于15℃和24℃的光照培养箱中,接种CMV后对其CMV RNA和siRNA积累进行了测定,结果显示在低温(15℃)下转基因烟草对CMV仍然具有抗性,基因沉默效率不受影响。 挑选转TMV部分移动蛋白基因的转基因烟草T0代抗病株系和感病株系种子,对其T1代幼苗进行Southern blot检测,结果表明T0代不同抗性株系间的拷贝数均存在很大差别,抗病性与拷贝数不存在相关性。对T1代幼苗的抗性测定发现,T0代为免疫型的植株在T1代时其抗病性发生分化,免疫型与感病型的比率约为1:1-3:1。T2代幼苗对TMV的抗性测定表明,T2代转基因株系能抗TMV。对T2代烟草Southern blot检测表明,T2抗病株系MP16-17-14,MP16-17-29,MP53-52-7等为单拷贝株系。对其T4代的抗性测定表明,转基因烟草中检测不到病毒。选择了抗性强且遗传性稳定的MP16-17-29-9株系,接种病毒后测定其T4代各三株转基因烟草中的TMV RNA和siRNA,结果表明转基因烟草在接种前后均能检测到信号很微弱的TMV RNA,而非转基因烟草接种病毒后存在大量的TMV RNA;转基因烟草中均能检测到24 nts和21 nts两种类型的siRNA,而非转基因烟草在接种前后均检测不到siRNA.说明了转基因烟草的抗病性主要是通过基因沉默降解病毒RNA而产生的。进一步测定表明在低温(15℃)下T4代转基因烟草对TMV依旧有很好的抗性。 将含部分CMV Rep (i/r)基因的农杆菌与番茄叶盘共培养,经卡那霉素抗性筛选获得转部分CMV Rep (i/r)基因的再生植株,PCR检测发现在随机抽取的转基因番茄中均能扩增到特异性条带,点杂交也均能杂到特异信号,说明获得了转部分CMV-Rep基因的转基因番茄,对其抗病性进行了初步研究。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:Q78

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【引证文献】
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