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《浙江大学》 2010年
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蝶蛹金小蜂cDNA文库抗菌肽基因筛选及表达研究

慎小晶  
【摘要】: 抗菌肽因其独特的生物活性以及不同于传统抗生素的特殊作用机理,引起了人们越来越多的关注。本研究针对传统抗菌肽基因的克隆与筛选技术耗时、费钱,效率较低,对蛋白/肽纯化要求高,以及难以发现新抗菌肽等的技术问题,建立了能筛选出具有抗菌活性的蛋白/肽及其基因的高效克隆筛选技术。 1.建立了蝶蛹金小蜂cDNA表达性文库,再筛选cDNA文库中具有抗菌活性的DNA序列。经核苷酸测序和序列比对,发现本实验所得到的阳性克隆所编码的产物主要是未见报道的新的短肽。同时,也发现了一个含有和蜜蜂的抗菌肽abaecin (Casteels et al.,1989)具有50%同源性的区域的阳性克隆PP30以及3个含有编码核糖体蛋白的序列的克隆(PP7、PP55、PP224)。 2.选取四个短肽(PP13、PP30、PP102、PP113)用于人工合成,检测发现这四个短肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都表现出了不同的抗菌活性,MIC值从PP13对S.lutea的8.0μM到PP102对E.coli的166.7μM。本研究也检测了不同浓度的抗菌肤(0-250μM)对小鼠血红细胞的溶血性。经过1小时的孵育,当抗菌肽浓度达到125μM时观察到很少比例的血细胞溶解,说明了这些抗菌肽对哺乳动物细胞是安全的。选择NaCl用以测定这四个抗菌肽的抗菌活性受盐离子浓度的影响。和其他部分抗菌肽一样(Zasloff,2002),这四个抗菌肽对大肠杆菌的活性随着NaCl浓度的增加而降低。 3.使用透射电镜观察的方法,初步测定所合成的蝶蛹金小蜂的抗菌肽对大肠杆菌的靶标位点。经研究发现,经过抗菌肽PP13处理的大肠杆菌细胞和正常的细胞相比,细胞膜受到了严重的损伤。这和最初筛选可能编码抗菌肽的cDNA序列时采用的染色方法的原理是一致的。正是由于这些抗菌肽作用于细菌的细胞膜,引起细胞膜形成空洞甚至裂解,才使得染料分子进入宿主细胞,从而发生染色反应。 4.本实验采用CD谱测定了合成的抗菌肽在10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)、50%TFE和25mM SDS水溶液中的二级结构,结果表明,所有的抗菌肽在10mM磷酸钠缓冲液中都没有确定的二级结构,以无规则线团形式存在。而在50%TFE溶液中,PP13、PP113的α-螺旋结构的含量都达到了100%,PP102的α-螺旋结构的含量为53.5%,在25mM SDS的水溶液中,PP13的α-螺旋结构的含量为100%。 5.将PP30基因在大肠杆菌表达系统pTRX/BL21中进行表达,获得了高效表达的可溶性融合蛋白His-PP30。并用抗His抗体的Western印迹分析证实了上述融合蛋白的表达。利用半定量RT-PCR分析大肠杆菌感染对蝶蛹金小蜂成虫体内PP30抗菌蛋白基因转录情况的影响。结果显示,PP30抗菌肽基因在不同浓度大肠杆菌处理及不同时间下均有转录,并随着大肠杆菌浓度的增加,转录水平也明显上升,而各个处理时间之间转录水平并没有明显差异。
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