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《浙江大学》 2010年
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中国柑橘炭疽病病原种类及种群遗传多样性研究

陈国庆  
【摘要】: 柑橘炭疽病是柑橘上重要的常发性病害,为害新梢、叶片、花器、幼果、果梗以及引起贮藏期蒂腐烂果,某些年份在局部地区会爆发流行带来巨大的经济损失。然而国际上有关柑橘炭疽病的研究并不深入,国内的研究更是屈指可数。本文就我国柑橘炭疽菌属(Colletotrichum spp.)真菌引起的病原种类,以及优势种群的种群遗传多样性开展了研究,获得如下结果。 对来自浙江,江西,广东,福建,湖南,重庆和云南等地不同柑橘类型(品种),不同发病器官的炭疽病材料进行分离培养,获得220个单孢菌株。依据在PDA培养基上的培养特征和分生孢子的形态,病菌可分为3个类型,A:菌落颜色白色至深青色,变化多样,生长速率1.2-1.7 cm/天,产生鲜红色分生孢子堆,孢子呈棍棒状,两端钝圆,大小12.5~18.6×4.7~6.0μm;B:菌落灰白色,生长速率0.6~0.8 cm/d,产生淡红色孢子堆,分生孢子梭形,两端尖,12.4-14.8×4.1~5.1μm;C:菌落青色,生长速率居于A,B之间,1.0-1.3 cm/d,产生橘黄色分生孢子堆,分生孢子新月形。测定这3个类型菌株的致病性表明:A和C类型菌株均能侵染椪柑(Citrus reticulata)嫩梢、花器和成熟的果实,引起典型的症状;而B类型菌株只能感染椪柑的花器,能够在椪柑的叶片和成熟果实上存活,但不能引起发病,其寄生具有很强的组织特异性。应用胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides和尖孢炭疽菌C. acutatum的种特异性引物CgInt/ITS4和CaInt/ITS4进行PCR扩增,发现引物CgInt/ITS4能从A类菌株扩增到约450bp目标片段,CaInt/ITS4能从B类菌株中扩增到约490bp目标片段,但该两对引物均不能从C类菌株扩增出片段。选取3种类型部分菌株应用通用引物ITS4/ITS5扩增rDNA-ITS区域,克隆测序结果在NCBI上比对,发现A类型菌株(HN-L01,JX-F10,CQ-L03,GD-B15)与胶孢炭疽菌C.gloeosporioides(AJ301988,AM947679)同源性为99%,B类型菌株(YN01,YN02,YN-3-16)与C. acutatum(AJ301964,AJ301932)的同源性为99%,C类菌株(XY-01,XY-02)与平头炭疽菌C. truncatum(AY266380,AJ301944)相似度为99%。综合国外文献和本研究结果,A和B型可确定为胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides和尖孢炭疽菌C. acutatum: C类型暂定为平头炭疽菌Ctruncatum,鉴于该病菌尚未在柑橘上发生和为害的报道,需要作进一步的研究确定。 在获得的菌株中,C. gloeosporioides占96.3%,分布各个采样省份,占据绝对优势;C. acutatum只是从云南瑞丽的莱檬(C.aurantifolia)上发现,占1.4%;而C. truncatum菌株来自云南和广东,只占2.3%。综上所述,引起我国柑橘炭疽病的病原有3个,以胶孢炭疽菌为优势种群。 利用5对引物Bt2a/Bt2b,GSF1/GSR1,GDF1/GDR1,CLl/CL2,ITS4/ITS 5分别扩增β-微管蛋白(beta tubulin-2-gene, BT),谷氨酸合成酶(glutamine-synthetase, GS),三磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GDPH),钙调蛋白基因(calmoudulin, Cal)和核糖体DNA转录间隔(ITS)的部分序列,应用软件MEGA4.0的邻接法(neighbor--joining method,N-J)构建系统进化树来研究柑橘上的C. gloeosporioides的群体遗传变异。 结果表明:ITS和BT基因序列都不能有效地揭示出C. gloeosporioides种下的变异水平,来自柑橘的菌株以高相似度聚为一类;Cal,GDPH,GS对揭示C. gloeosporioides群体遗传变异是有效的,其中C. gloeosporioides群体依Cal序列可聚为Cal-Ⅰ和Cal-Ⅱ两个亚群,依GDPH可聚为GD-Ⅰ和GD-2Ⅱ两个亚群,依GS序列聚为GS-Ⅰ,GS-Ⅱ,GS-Ⅲ,GS-Ⅳ共4个亚群。3种基因序列形成的各亚群间在菌株构成上有一定的重合性,但又不尽相同。最后将5个基因序列合并后构建的系统进化树显示除了丰富的遗传多样性,包括Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ,Ⅶ,Ⅷ共8个小亚群。其中Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ构成大亚群Group A, VI,Ⅶ构成另一个大类群Group B。综合分析发现,柑橘上C. gloeosporioides群体遗传变异与地理来源,寄主种类,发病器官等均没有相关性,而与分生孢子的形态大小存在一定的相关性,即,Group A的菌株分生孢子为长棍棒状,长而窄,大小为16.3~18.6×4.7~5.3μm,平均为16.9×5.0μm;Group B菌株的分生孢子为短棍棒形,短而宽,大小12.5~14.7×4.9~6.0μm,平均为13.9×5.4μm.
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S436.66

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