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禽病原性大肠杆菌O2菌株跨膜输出蛋白基因文库的构建与分析

谭双  
【摘要】: 禽病原性大肠杆菌是重要的禽病原菌,可以引起家禽局部或全身性的感染,包括呼吸道感染(气囊炎和肺炎)、心包炎、肝周炎和败血症等,给养禽业造成重大损失。大肠杆菌O2菌株作为一种优势血清型,更是能够广泛感染各种家禽。禽病原性大肠杆菌的跨膜输出蛋白尤其是那些只在体内特殊条件下才能表达的蛋白是免疫识别的主要抗原,在预防疾病中发挥重要作用。 本实验选择可调控启动子的跨膜输出蛋白选择克隆载体pMB-Ara-T,克隆禽病原性大肠杆菌02菌株的跨膜输出蛋白基因。主要涉及T载体的制备、目的片段的制备、文库的获得三方面。目的片段的获得主要通过随机PCR(Random PCR, rPCR)方法。首先用Klenow法延伸获得rPCR的模板:以30N8(末端含有8个随机碱基)为引物,将抽提的禽病原性大肠杆菌02菌株基因组DNA作为模板,进行Klenow延伸;其次以OL30作为引物、Klenow延伸产物为模板进行rPCR扩增,电泳显示得到大小集中在200bp-2000bp的rPCR产物;最后割胶回收大小集中在250-500bp的rPCR产物,将质粒pMB-Ara-T经XcmI酶切纯化后与纯化后的rPCR产物连接,连接产物转化到感受态DH5α.文库的获得包括文库容量和文库质量两个标准。为了达到105的库容量,连接产物共转化10次,转化液加甘油至10%,得到约11ml转化液,-20℃保存。取10ul转化液涂布于Kan抗性平板,长出170个克隆,估算11ml转化液组成了2.0×105个克隆的基因组文库。文库质量采用菌落PCR检测,随机挑取Kan平板上的13个菌落,PCR结果显示12个菌落中插入了外源片段,文库插入率大约为92%,片段大小集中在250bp-1000bp之间。 将甘油保存的文库复苏并涂布到含有筛氨苄青霉素(ampicillin,Amp)、卡那霉素(kanamycin,Kan)和诱导剂1.0%阿拉伯糖(arabinose,ara)平板筛选共获得318个克隆子,318个克隆再点种到含有Amp和Kan的平板上筛选得到29个克隆。对获得的这些克隆进行测序、BLAST分析表明这318个克隆插入片段高度同源于禽病原性大肠杆菌K12基因组中的276个基因,其中自主表达的29个克隆同源于27个基因。ORF分析结果表明,这318个克隆子有144个克隆(对应于大肠杆菌K12基因组中的128个基因)含有完整的启动子序列结构,除去自主表达的29个克隆(对应于27个基因),推测余下的115个克隆(对应于101个基因)的启动子为LB培养条件下沉默的启动子,需要特殊条件诱导表达。Signal P预测大肠杆菌K12基因组的4542个基因,有342个基因编码信号肽,占总基因数的比例约等于1/13;同时分析318个克隆的插入片段序列发现都含有信号肽结构,未克隆到与Signal P预测结果不一致的基因片段,克隆到信号的概率为276:342。基因跨膜螺旋结构预测表明:318个克隆中有78个克隆含有一个或一个以上的跨膜螺旋结构预测为膜蛋白。对插入片段所对应的基因进行功能分析,除去约26%的基因功能未知,剩余基因的功能主要集中在跨膜转运、代谢过程、蛋白折叠以及组成细胞外膜成分。 实验结果证明载体pMB-Ara-T可以通过直接克隆rPCR产物的方式选择性地克隆和筛选编码有信号肽序列的跨膜输出蛋白基因。筛选得到的分泌蛋白和膜蛋白基因为进一步研究禽病原性大肠杆菌02菌株毒力、免疫原性及其基因的功能和表达调控提供有利条件。


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