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《浙江大学》 2008年
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高效水解大豆异黄酮β-葡萄糖苷酶及其对肉公鸡生产性能的影响研究

钱利纯  
【摘要】: 本课题筛选了高产β-葡萄糖苷酶的菌种,并研究黑曲霉的发酵特性和酶学特性,优化了β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮的最佳条件,对β-葡萄糖苷酶基因进行了克隆和序列分析;并以艾维茵肉用公雏为试验对象,研究了β-葡萄糖苷酶对肉公鸡生长、大豆异黄酮的吸收代谢、肉质、脂肪代谢、抗氧化能力及激素水平的影响,从而揭示了β-葡萄糖苷酶的促生长机理。 1.菌种筛选和鉴定 从自然界筛选的6个菌种进行发酵产β-葡萄糖苷酶的研究,结果表明,zju2的固体发酵和液体发酵产β-葡萄糖苷酶活性均最高,说明zju2最适合用于发酵生产β-葡萄糖苷酶;对zju2的基因组进行提取,采用真菌通用引物对菌种18SrDNA进行PCR扩增及产物克隆,并进行序列分析,序列用BLAST程序和GenBank数据库进行同源性比较分析,结果表明该菌种与黑曲霉(Aspergillus nigerD63697)同源性高达99%,进化树距离最近,综合菌落形态和产孢子性能,该菌种被鉴定为黑曲霉,命名为黑曲霉zju2 (A.niger zju2)。 2.黑曲霉zju2发酵特性研究 本试验以黑曲霉zju2为出发菌株,对其产β-葡萄糖苷酶最佳固体培养基和发酵条件进行了优化。结果表明,以麸皮为主要培养基,玉米芯粉比率20%以下或米糠比率10%以下,适合黑曲霉产β-葡萄糖苷酶,单独使用麸皮为固体培养基更适宜黑曲霉生长;黑曲霉产β-葡萄糖苷酶不需添加碳源;添加2%的无机氮(硫酸铵、硝酸铵、氯化铵和尿素),均可提高酶活性,添加量高于2%时,显著降低β-葡萄糖苷酶活性;分别添加2-6%蛋白胨、4%酵母提取物、2%豆粕和4%棉籽粕,β-葡萄糖苷酶活性显著提高。培养基含水量为70%、接种量为107cfu/g培养基、培养基pH6.0、发酵温度28℃和培养时间72h为黑曲霉产β-葡萄糖苷酶的最优条件,优化后酶活高达508U/g。 3.黑曲霉zju2β-葡萄糖苷酶的酶学特性研究 采用酶学研究方法,通过硫酸铵沉淀、Sephadex G-25脱盐和Sephadex G-100纯化了β-葡萄糖苷酶,并进行了黑曲霉β-葡萄糖苷酶的最适反应温度、最适pH、热稳定性、pH稳定性及米氏常数等特性研究;采用SDS-PAGE凝胶电泳测定了分子量。研究表明,β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为70℃、最适反应pH为4.5;在40℃、50℃和60℃下较稳定,80℃以上稳定性差;β-葡萄糖苷酶在pH为3、7、8、9的缓冲液中的稳定性很差,在pH为4、5、6的缓冲液中稳定性较好,其中在pH为5时,稳定性最好;酶的Km=41.67mM, Vmax=23.81U/L;其分子量为65.2kDa。 4.黑曲霉zju2β-葡萄糖苷酶体外酶解效率研究 选用含量40%的大豆异黄酮(结合型占86.33%)和黑曲霉产β-葡萄糖苷酶为研究对象,以水解时间、温度和酶量为试验因素,以酶解产物游离型苷元含量为判断标准,采用三因素五水平二次回归通用旋转组合设计方案进行研究。结果表明:在游离型苷元含量(y)与反应时间、反应温度与酶量之间可建立数学模型:(?)=0.876+0.029 X1-0.071 X2+0.072 X3-0.048X1X2+0.015 X1X3+0.017X2X3-0.035 X12-0.074 X22-0.091 X32,模型的复相关系数为0.86,达极显著水平,模型有效;在本试验所选水平范围内,对水解率的影响程度大小依次为:酶量温度时间。通过优化,黑曲霉β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮的最佳反应参数为时间5.3h,温度55.4℃,酶量68.7 U/g。 5.黑曲霉zju2β-葡萄糖苷酶基因克隆及序列分析 试验采用Trizol法提取总RNA,以反转录出的cDNA为模板进行PCR扩增,并进行序列测定及结构预测。研究表明,黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因全长2583bp,编码860个氨基酸,理论分子量为93.2kDa,理论等电点为4.45。结构预测表明,β-葡萄糖苷酶信号肽切割位点在第19个氨基酸和第20个氨基酸之间,β-葡萄糖苷酶成熟肽片段为841个氨基酸,理论分子量为91.2kDa;成熟肽中含有15个潜在的糖基化位点;二级结构预测表明,该蛋白中含无规卷曲568个,占67.54%,α-螺旋为165个,占19.62%,含折叠108个,占12.84%;该酶与蛋白质库中1ex1具有相似的三维构象,同源性为23.7%。 6.β-葡萄糖苷酶对肉公鸡生产性能的影响及机理研究 选用1日龄的艾维茵肉用公雏为试验对象,设对照组和添加0.2%(0.6U/g饲粮)、0.4%(1.2U/g饲粮)及0.6%(1.8U/g饲粮)酶制剂的试验组,每组设4个重复,每个重复15羽,研究该酶对肉公鸡生长的影响并探讨其作用机理。试验表明:(1)β-葡萄糖苷酶能改善生产性能:饲粮中添加0.2%(0.6U/g饲粮)的β-葡萄糖苷酶使肉鸡日增重显著提高了8.26%(p0.05),添加0.2%、0.4%和0.6%β-葡萄糖苷酶分别使料重比降低了5.8%(p0.01)、2.68%(p0.01)和2.23%(p0.05)。(2)饲粮中添加0.2%β-葡萄糖苷酶能提高大豆异黄酮的利用率:β-葡萄糖苷酶对大豆异黄酮的吸收和代谢有显著的影响,使肉鸡血清中结合型大豆异黄酮降低了68.02%。(3)饲粮中添加0.2%β-葡萄糖苷酶能改善肉质:使肉公鸡滴水损失率降低了22.00%(p0.05),胸肌L·值降低了11.17%(p0.01),胸肌a·值提高了41.81%(p0.01)。(4)饲粮中添加0.2%β-葡萄糖苷酶能提高消化机能:添加0.2%β-葡萄糖苷酶使肉鸡胰重率显著降低了18.08%(p0.05),肝重率降低了8.19%(p0.05);β-葡萄糖苷酶使肉鸡十二指肠淀粉酶活性提高了30.43%(p0.05),脂肪酶和胰蛋白酶分别提高12.40%(p0.05)和57.93%(p0.05)。β-葡萄糖苷酶使肉鸡粗蛋白和粗脂肪消化率显著提高了9.02%(p0.05)和7.40%(p0.01)。(5)饲粮中添加0.2%β-葡萄糖苷酶对骨骼生长发育无显著影响:对肉公鸡的股骨、胫骨生长无明显影响,与骨骼生长相关的血清指标钙、磷和碱性磷酸酶也无显著变化。(6)饲粮中添加0.2%β-葡萄糖苷酶对脂肪代谢某些指标产生影响:β葡萄糖苷酶对肉鸡的腹脂沉积、肌肉之间的脂肪沉积和尾部脂肪沉积都无显著影响,β-葡萄糖苷酶对肉鸡脂肪组织中HSL和LPL的活性均无显著影响;β葡萄糖苷酶对肉公鸡甘油三酯、游离脂肪酸和总胆固醇没有显著影响,高密度脂蛋白胆固醇显著提高了15.10%(p0.05),低密度脂蛋白胆固醇降低了36.43%(p0.01)。(7)β-葡萄糖苷酶提高肉鸡的抗氧化能力:显著提高了肉鸡血清中超氧化物歧化酶的活性提高了16.45%(p0.05),而使丙二醛的含量降低18.16%(p0.05),肝脏中谷胱苷肽过氧化物酶和谷胱苷肽还原酶活性分别提高了33.00%(p0.05)和14.88%(p0.05)。(8)β-葡萄糖苷酶能促进激素分泌:睾酮和雌二醇分别提高了51.43%(p0.05)和14.59%(p0.05),IGF-I提高了57.78%(p0.05)。 研究表明,β-葡萄糖苷酶可以在肉鸡消化道酶解结合型大豆异黄酮,提高大豆异黄酮的利用率,从而改善肉鸡生产性能。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S831

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【引证文献】
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中国硕士学位论文全文数据库 前2条
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