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《浙江大学》 2007年
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提高木聚糖酶热稳定性、催化活性和结合水解纤维素能力的研究

刘明启  
【摘要】: 为了提高木聚糖酶的热稳定性、催化活性和底物的结合水解性能,本研究以G/11家族黑曲霉木聚糖酶A(Aspergillus niger xylanase A, AnxA)和褐色高温单孢菌木聚糖酶A(Thermomonospora fusca xylanase A, TfxA)为亲本,设计出两种杂合木聚糖酶基因,并系统研究了毕赤酵母表达的杂合木聚糖酶及其亲本酶的酶学性质。主要研究结果如下: 1杂合木聚糖酶基因atx的分子设计和表达 为了提高AnxA的热稳定性和催化活性,其催化结构域N-末端序列被TfxA中相应序列所取代,获得的杂合木聚糖酶基因atx在大肠杆菌中的表达产物EATx主要以包涵体形式存在。atx在毕赤酵母中获得表达,其表达产物PATx和AnxA具有相同的催化活性中心。经0.25%甲醇诱导培养96h,基因工程菌pPATx86发酵上清液中木聚糖酶PATx活性为633.0 U/mg,分别是酵母表达黑曲霉木聚糖酶A (reAnxA)和酵母表达褐色高温单孢木聚糖酶A (reTfxA)的3.6倍和5.4倍。因此,通过N-末端序列替换显著提高了AnxA的催化活性。进一步分析表明,IPATx、reAnxA和reTfxA均无纤维素酶活性。 2杂合木聚糖酶PATx及其亲本酶的酶学性质 PATx的最适温度和最适pH分别为60℃和pH5.0;在70℃、pH5.0条件下处理2 min,残余酶活为72%;在pH3.0.9.0,25℃条件下处理1h,残余酶活均在80%以上。reAnxA的最适温度和最适pH分别是50℃和pH5.0;在70℃、pH5.0条件下处理2 min,残余酶活为42%;在pH3.0-8.0,25℃条件下处理1h,残余酶活均在80%以上。reTfxA的最适温度和最适pH分别是60℃和pH6.0;在70℃、pH6.0条件下处理2 min,残余酶活为70%;在pH5.0-9.0,25℃条件下处理1h,残余酶活均在80%以上。SDS-PAGE结果表明,IPATx的相对分子量为20.78 kDa,与理论推算的分子量(21.04 kDa)相吻合。杂合木聚糖酶PATx具有较好的pH稳定性。通过与TfxA的N-末端序列替换显著提高了AnxA的热稳定性,表明reTfxA的N-末端序列与酶蛋白的热稳定性密切相关。 小麦木聚糖酶抑制剂TAXI-I对PATx、reAnxA和reTfxA均具有抑制活性。相同酶活的PATx、reAnxA和reTfxA分别与TAXI-I在20℃下作用30 min,其残余酶活分别为35.0%、18.0%和85.3%。表明,TfxA的N-末端序列替换提高了AnxA对小麦木聚糖酶抑制剂的抗性。 采用高效液相色谱(HPLC)法,对杂合木聚糖酶PATx及其亲本酶水解桦木木聚糖和小麦麸皮不溶木聚糖产物的分析表明,杂合木聚糖酶PATx水解桦木木聚糖和小麦麸皮不溶木聚糖产物分别为木糖至木五糖、木糖至木六糖,其主要产物均为木三糖;reAnxA水解桦木木聚糖和小麦麸皮不溶木聚糖产物分别为木糖至木五糖、木糖至木六糖,其主要产物均为木三糖;而reTfxA水解桦木木聚糖和小麦麸皮不溶木聚糖产物均为木糖至木六糖,其主要产物均为木二糖。 以低聚木糖为底物对杂合木聚糖酶PATx及其亲本酶的水解模式研究表明,杂合木聚糖酶PATx为内切型木聚糖酶,其对木二糖和木三糖没有水解活性,能够水解木四糖、木五糖和木六糖,最小水解单元为木四糖;reAnxA和reTfxA均能水解木二糖至木六糖,二者最小水解单元均为木二糖;且PATx、reAnxA和reTfxA均具有转糖苷化活性。 3杂合木聚糖酶基因atxx的分子设计和表达 为了提高杂合木聚糖酶PATx对纤维素类底物的结合和水解能力,将TfxA的连接序列和木聚糖结合域(XBD)融合在PATx的C-末端,获得的杂合木聚糖酶基因atxx在毕赤酵母中获得分泌表达,表达产物为PATxX。经0.25%甲醇诱导培养96h,基因工程菌pPATxXl发酵上清液中PATxX的木聚糖酶活性和纤维素酶活性分别为452.1 U/mg和19.3 U/mg。 4杂合木聚糖酶PATxX的酶学性质 PATxX木聚糖酶的最适温度和最适pH分别为60℃和pH5.0,与杂合木聚糖酶PATx相同。PATxX在70℃、pH7.0下处理2 min,残余酶活为66%;在pH4.0-9.0,25℃下处理1h,残余酶活均不低于80%。PATxX木聚糖酶与小麦木聚糖酶抑制剂作用后其残余酶活为41.0%。 杂合木聚糖酶PATxX水解桦木木聚糖产物为木糖至木五糖,主要产物为木三糖;PATxX水解小麦麸皮不溶木聚糖产物为木糖至木六糖,主要产物为木六糖,其次为木二糖和木三糖。IPATxX为内切型木聚糖酶,对木二糖至木六糖均具有水解活性,最小水解单元为木二糖,并具有转糖苷化活性。 25℃,结合3h后,PATxX和reTfxA对1%微晶纤维素的结合率分别为3.7%和7.6%,而PATx和reAnxA无结合微晶纤维素的能力。PATx、reAnxA和reTfxA均无纤维素酶活性。PATxX纤维素酶的最适温度和最适pH分别为60℃和pH6.0。SDS-PAGE结果表明,PATxX的相对分子量为33.01 kDa,与理论推算的分子量(32.15 kDa)相吻合。通过与TfxA的连接序列和木聚糖结合域融合,使PATx具备了结合水解纤维素的能力。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S816

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【引证文献】
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1 高慧;孙建义;刘明启;;木聚糖酶TAXI型抑制蛋白的研究进展[J];动物营养学报;2006年S1期
2 罗士津;S.Moehn;J.K.A.Atakora;J.Sands;R.O.Ball;;小麦基础日粮中添加植酸酶-木聚糖酶对肥育猪能量代谢的影响[J];国外畜牧学(猪与禽);2007年05期
3 黄亚东,郑青,李校,姚汝华,黄自然;抗菌肽AD基因的改造及在毕赤酵母中的表达[J];华南理工大学学报(自然科学版);2002年02期
4 李文鹏,廖昌珑,刘士清,王佳,周建国;耐碱芽孢杆菌YNUCCTCRQ1木聚糖酶及其产生菌的系统发育分析[J];林产化学与工业;2004年04期
5 石波,李里特;玉米芯酶法制取低聚木糖的研究[J];中国农业大学学报;2001年02期
6 赵翔,霍克克,李育阳;毕赤酵母的密码子用法分析[J];生物工程学报;2000年03期
7 江正兵,宋慧婷,马立新;短小芽孢杆菌木聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究[J];生物工程学报;2003年01期
8 杨浩萌,姚斌,罗会颖,张王照,王亚茹,袁铁铮,柏映国,伍宁丰,范云六;木聚糖酶XYNB分子中折叠股B1和B2间的疏水作用对酶热稳定性的影响[J];生物工程学报;2005年03期
9 胡沂淮,邵蔚蓝;木聚糖酶[J];生命的化学;2002年03期
10 黄家骥,许正宏,陶文沂;以Bacillus pumlis.木聚糖酶水解玉米芯制备木寡糖[J];食品与发酵工业;2004年05期
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1 江正强;海栖热袍菌xynB基因的克隆和表达、重组木聚糖酶的提纯及其酶学性质[D];中国农业大学;2001年
2 石波;玉米芯酶法制备低聚木糖的研究[D];中国农业大学;2001年
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1 赵恭文;刘建军;李长松;李林;张博;齐军山;;微生物发酵法生产2,3-丁二醇瓶颈因素分析[J];山东农业科学;2011年11期
2 潘真清;陈涛;;利用啤酒糟液体深层培养风尾菇产木聚糖酶的初步研究[J];安徽工程科技学院学报(自然科学版);2010年02期
3 王中兴;;木聚糖酶最适反应条件的研究[J];安徽农学通报;2008年09期
4 杨书艳;徐春梅;邬敏辰;;用玉米芯酸酶法制备低聚木糖的研究[J];安徽农业科学;2007年12期
5 姬小明;吕全建;赵铭钦;;低聚木糖的特性及应用研究进展[J];安徽农业科学;2007年23期
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7 惠明;窦丽娜;田青;侯银臣;;枯草芽孢杆菌的应用研究进展[J];安徽农业科学;2008年27期
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3 邬敏辰;张慧敏;唐存多;李剑芳;;木聚糖酶固态发酵培养基的优化[A];饲用酶制剂开发与应用技术交流研讨会论文集[C];2010年
4 勇强;徐勇;宋向阳;余世袁;;玉米秸秆生物转化制取酒精的中间试验[A];中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集[C];2005年
5 史宝军;陈丽芝;崔细鹏;胡悦;吕东海;周镇峰;;木聚糖酶酶学特性及其催化功能的研究进展[A];饲料营养研究进展——第五届全国饲料营养学术研讨会论文集[C];2006年
6 史宝军;崔细鹏;王敏;鲍淑青;;木聚糖酶酶学特性及其催化功能的研究进展[A];饲料酶制剂的研究与应用[C];2009年
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2 李明;双宝;李海涛;王晴;高继国;;枯草芽孢杆菌的研究与应用[J];东北农业大学学报;2009年09期
3 臧家涛;李淑慧;李鹏;陈安;胡川闽;;应用DNA shuffling及T7噬菌体展示技术定向进化并筛选鉴定sCD74突变体[J];第三军医大学学报;2008年08期
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6 何云;崔金忠;郑素玲;王岩峰;张亮;;木聚糖酶在水产养殖中的应用研究进展[J];广东农业科学;2008年10期
7 张小霞,严卫星,徐海滨;外源蛋白质表达系统类型的研究进展[J];国外医学(卫生学分册);2004年04期
8 吕中原;钱江潮;储炬;郭美锦;王永红;庄英萍;张嗣良;;同时利用AOX1和GAP启动子表达SAM合成酶促进重组毕赤酵母中S-腺苷甲硫氨酸积累[J];工业微生物;2008年04期
9 王修启,陈杰,林东康,秦磊,常娟;皖麦38添加木聚糖酶对鸡表观代谢能值和氨基酸表观消化率的影响[J];华北农学报;2003年01期
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1 叶玉坤,叶松广,毛秋霞, 黄自然,徐飞,庄楚雄,陈章良,温刘发;柞蚕抗菌肽D基因在酵母中表达的研究[J];蚕业科学;1994年02期
2 赵翔,李至,陆身枫,霍克克,李育阳;酵母Yarrowia lipolytica的密码子用法分析[J];复旦学报(自然科学版);1999年05期
3 毕瑞明,孙迅,任少亭;黑曲霉产木聚糖酶发酵条件的研究[J];工业微生物;2000年01期
4 郑宗坤;高孔荣;浦跃武;;直接加热膨化蔗渣的酶解研究[J];甘蔗糖业;1992年05期
5 陈洪章,刘健,李佐虎;半纤维素蒸汽爆破水解物抽提及其发酵生产单细胞蛋白工艺[J];化工冶金;1999年04期
6 刘曼西,黄鲲,陈琼,孙世光;两种真菌的木聚精酶的催化性质研究[J];华中理工大学学报;1998年02期
7 黄自然,郑庭辉,梁怡章,屈贤铭;柞蚕抗菌肽的抑菌效应[J];科学通报;1986年14期
8 洪枫,单谷,孙伟东,刘超纲,余世袁;采用蒸汽爆破技术制备木低聚糖的尝试[J];林产化工通讯;1999年06期
9 洪枫,陈琳,余世袁,沈兆邦;新型功能性低聚糖的生产与研究[J];林产化工通讯;1999年04期
10 唐爱民,梁文芷;纤维素预处理技术的发展[J];林产化学与工业;1999年04期
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5 龚叶;黄顺斌;郭蔚;毕先钧;;离子液体中微波辅助制备硼掺杂纳米TiO_2及光催化活性[A];第六届全国工业催化技术及应用年会论文集[C];2009年
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