多杀性巴氏杆菌跨膜蛋白基因的选择克隆

【摘要】： 多杀性巴氏杆菌是重要的畜禽病原菌,可以引起猪肺疫、牛出败、禽霍乱等,给畜牧业造成重大损失；同时它也是人类的机会性致病菌,能够引起人类呼吸道的多种感染或继发感染。研究表明,PM的外膜蛋白尤其是那些只在体内特殊条件下才表达的膜蛋白是免疫识别的主要抗原,在预防疾病中发挥重要作用。 本实验选择可调控载体pMB-Ara来克隆多杀性巴氏杆菌C48-19的膜蛋白基因,构建了BamHI位点的基因组文库。部分文库经Amp+Kan+1.0% arabinose和Amp+Kan平板筛选共获得6个克隆子,PCR和酶切显示所有的筛选克隆均有基因组片段的插入,插入片段大小分布在500～1000bp。 序列测定、BLAST分析等结果表明,6个克隆子中有5个含有完整的启动子序列结构,且对应于多杀性巴氏杆菌Pm70的某些基因,推测这些基因的启动子为E. coli中沉默的启动子,可能只在特殊诱导条件下才开放。 为更简单、更全面地克隆跨膜输出蛋白基因,我们在pMB-Ara载体的基础上,设计反向互补的XcmI接头引物,克隆入EcoRI酶切的载体,获得具有T载体性质的膜蛋白基因选择克隆载体pMB-Ara-T,大小为4780bp。 为证明新建载体的有效性,从质粒pBR322上PCR扩增缺失启动子的已知跨膜分泌蛋白基因---四环素抗性基因片段(△PTet,315bp),与pMB-Ara-T/XcmI连接,Kan+Amp和Kan+Amp+Arabinose平板分别筛选,只在后者获得阳性克隆子。PCR和酶切确定AP Tet基因已以阅读框对位的方式插入,Ara启动子驱动了△PTet基因和报告基因(△P△SP Amp)的融合表达和跨膜分泌。 pMB-Ara-T载体系统的建立,为下一步利用rPCR方法构建文库奠定基础,从而为进一步研究多杀性巴氏杆菌毒力、免疫原性等相关的跨膜蛋白及其基因的功能和表达调控提供有利工具。