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《浙江工业大学》 2010年
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光学纯3-羟基戊二酸乙酯的生物催化合成

董华平  
【摘要】:阿托伐他汀(Atorvastatin)、瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)等他汀类药物是目前治疗高血脂症的首选药物,L-肉碱是生物体新陈代谢必不可少的功能性物质。而(R)-3-羟基戊二酸乙酯和(S)-3-羟基戊二酸乙酯作为合成他汀类药物侧链和L-肉碱的重要中间体,对其合成研究具有非常重要的经济和社会效益。目前为止,这两种手性化合物合成路线和所使用的催化剂比较单一,对生物催化过程的研究也不够深入,产物的产率和光学纯度也都不高,无法满足作为他汀类侧链等药物中间体的要求,而且市场上也没有相关的标准品出售和报道,因此,这两种手性化合物的合成研究一直停滞不前。本文主要以微生物全细胞和酶这两种典型的生物催化剂,通过对(S)-3-羟基戊二酸乙酯酶催化合成过程和机理的详细研究,得到了光学纯度较高的(S)-3-羟基戊二酸乙酯;通过设计新的合成途径,筛选新的生物催化剂,经过微生物细胞一步催化合成光学纯度较高的(R)-3-羟基戊二酸乙酯,并从新的微生物的筛选、鉴定、制备和应用等方面作了详细的研究。 本文首先建立了一种新的3-羟基戊二酸乙酯的液相分析方法,引入了离子对液相色谱法,解决了一直备受困扰的分离组分的保留问题。从而为仔细研究该产物的细胞和酶催化过程和机理,优化反应条件打下了坚实的基础。利用固定化脂肪酶Novozym 435(CALB)不对称催化水解潜手性底物3-羟基戊二酸二乙酯制备(S)-3-羟基戊二酸乙酯,产物通过半制备型液相色谱分离、乙酸乙酯萃取等提纯手段得到了纯度较高的(S)-3-羟基戊二酸乙酯,并通过UV、IR、ESI-MS、NMR和测定比旋光度等分析方法对产物结构和构型进行了鉴定,并确定该产物确为(S)-3-羟基戊二酸乙酯。对于该物质的ee值难以准确测定的问题,本文建立了一套新的ee值分析方法,即先通过该产物与手性胺(R)-(+)-苯乙胺进行化学衍生化反应生成一对用普通硅胶柱就能分离的差向异构体,根据测定各自色谱峰的面积,就能准确计算出(S)-3-羟基戊二酸乙酯的ee值,从而解决了无法用手性柱分离(R)-和(S)-3-羟基戊二酸乙酯的难题。 通过对Novozym 435不对称催化水解3-羟基戊二酸二乙酯反应条件和过程的优化,对反应过程中外扩散和内扩散阻力对反应过程的影响详细研究,得到了最佳反应条件:pH 7.0,温度40 oC,底物浓度0.15 mol/L,转速200 rpm,在该条件下,制备得到纯度较高的(S)-3-羟基戊二酸乙酯(ee 95%)。通过对反应抑制动力学研究,发现副产物乙醇对Novozym 435具有反竞争性抑制作用,经回归分析获得各表观动力学常数:Vmax 1.29 mmol/min·g、Km 0.06 mol/L、Ki 0.37 mol/L。 建立了能立体选择性催化水解3-羟基4-氰基丁酸乙酯为(R)-3-羟基戊二酸乙酯的腈水解酶菌株的高通量筛选模型,该模型基于在pH 7.0、20 mM的Tris-HCl缓冲溶液中,Co2+能与水解反应产生的游离氨络合生成[Co2+(NH3)]2+,同时颜色由品红色变成淡黄色,解决了在本水解反应中难以对底物的消耗量和产物增加量进行快速分析的难题。通过该高通量筛选方法,筛选到了一株酶活和立体选择性都较高的菌株ZJB-0910,而且该微生物细胞只水解3-羟基4-氰基丁酸乙酯中的氰基,而不水解该底物中的酯基,解决了通常的水解酶菌株细胞都会水解底物中酯基的难题,实现了化学选择性水解。并同样通过IR、ESI-MS、NMR和测定比旋光度等分析方法对产物结构和构型进行了鉴定,确定该产物为(R)-3-羟基戊二酸乙酯。通过形态学、生理生化实验、16S rDNA序列及系统发育分析,ZJB-0910被鉴定为红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)。这是第一次报道该种内的腈水解酶能立体选择性催化水解外消旋的手性中心在β位的羟基脂肪腈,而一般常识认为和α-羟基腈相比,腈水解酶很难实现β-羟基腈类化合物的手性识别。 通过单因素和响应面法对R. erythropolis ZJB-0910产腈水解酶的培养基成分进行了优化。确定适宜的培养基组分为(g/L):葡萄糖20.986,酵母膏8.468,MgSO4 0.22,K2HPO4 0.5,KH2PO4 0.5。同时也确定适宜的培养条件:温度30 oC,接种量3%,装液量20%,初始pH 7.0。在上述培养条件下培养45 h后,生物量达到4.23 g/L,腈水解酶的活力达到75.6 U/g。并通过考察己内酰胺等诱导剂对R. erythropolis ZJB-0910产酶途径的影响,确定该菌种有腈水解酶以及腈水合酶和酰胺酶两条产酶途径,腈水解酶不需要任何诱导剂的诱导,所以其可能为组成型的腈水解酶。 考察了pH、温度、底物和产物浓度等参数对R. erythropolis ZJB-0910静息细胞立体选择性催化水解消旋底物(R/S)-3-羟基4-氰基丁酸乙酯反应过程的影响。得到了最适反应条件:温度30 oC, pH 7.5,(R/S)-3-羟基4-氰基丁酸乙酯浓度20 mM,静息细胞1.6 g DCW L-1,在该反应条件下反应4 h,得到产物(R)-3-羟基戊二酸乙酯(E 200),而ee值和转化率分别为 99%和46.2%。通过对该菌株细胞在30 oC和40 oC下的热稳定性研究发现,在上述两温度下的半衰期分别为93.3和37.6 h。考察了底物和产物浓度对催化过程的影响,发现底物(R/S)-3-羟基4-氰基丁酸乙酯对酶活没有抑制作用;而产物(R)-3-羟基戊二酸乙酯则对反应存在明显的抑制作用。通过抑制动力学研究发现,(R)-3-EHG的抑制类型为非竞争性抑制,抑制常数Ki为0.028 M,而Km和Vmax分别为0.01 M和85.6μmol/min·g。通过对该游离细胞的重复性能研究发现,该细胞重复使用八批之后,剩余酶活为初始酶活的50%左右,说明该细胞的重复使用性能是比较好的。
【学位授予单位】:浙江工业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:TQ463.2

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