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《浙江工业大学》 2011年
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Pseudomonas stutzeri LYS-86反硝化基因克隆及荧光标记

魏民  
【摘要】:近几个世纪,由于工业的迅猛发展导致环境受到极其严重的污染,而氮素是水体中的主要污染物。目前应用最广泛的氮素污染控制方法之一是生物脱氮技术,即利用微生物完成硝化和反硝化作用,使氮素循环恢复正常。脱氮过程尤其是生物膜脱氮过程的研究一直是广受关注的领域,其中脱氮菌的荧光标记有利于对其在生物膜中作用机理的解析。 本实验室已分离到一株具有好氧反硝化功能的菌株Pseudomonasstutzeri LYS-86,在有氧条件下,能够高效脱氮,且生长良好,具有潜在的工程应用价值。本文通过GenBank公布的编码硝酸盐还原酶,亚硝酸盐还原酶,一氧化氮还原酶以及一氧化二氮还原酶的基因序列,设计特异性引物,从Pseudomonas stutzeri LYS-86基因组中克隆得到了narG,nirS,norC和nosZ基因,从基因水平上佐证了菌株P. stutzeriLYS-86的反硝化功能,为其工业应用提供理论依据。 脱氮菌Pseudomonas stutzeri LYS-86能吸附于海藻酸钙凝胶珠表面形成生物膜,为便于实时监测和考察该菌生物膜的形成与变化情况,需要构建荧光标记菌株。本文构建了含有Pseudomonas stutzeri LYS-86亚硝酸盐还原酶启动子Pnir的转座载体pUT/mini-Tn5-km2-Pnir-gfp,通过双亲本结合转座将mini-Tn5-km2-Pnir-gfp转座臂整合到P. stutzeri染色体中,得到重组菌P. stutzeri LYS-Pnir-gfp,荧光显微镜下观察发现重组菌P. stutzeri LYS-Pnir-gfp发出均匀的绿色荧光。在无选择压力下连续移植16次,重组菌P. stutzeri LYS-Pnir-gfp基因组中Pnir-gfp片段均未丢失,而且荧光发光稳定,荧光发光率保持在100%;重组菌P. stutzeri LYS-Pnir-gfp的脱氮功能也没有受到明显影响。荧光标记菌P. stutzeri LYS-Pnir-gfp可用于脱氮微生物生物膜的研究。
【学位授予单位】:浙江工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:X703;X172

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