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《浙江工业大学》 2015年
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灰葡萄孢乳酸转运蛋白基因Bcjen1功能研究

任云  
【摘要】:本研究用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的乳酸转运蛋白基因ScJen1序列blast搜索灰葡萄孢(Botrytis cinerea)基因组数据库,发现灰葡萄孢中存在一个与酿酒酵母ScJen1高度同源基因BC1G_03160.1,编码一个与羧酸转运蛋白相似的假定蛋白,称为BcJEN1。本研究以灰葡萄孢的单倍体菌株B05.10为实验材料,对灰葡萄孢Bcjen1基因功能进行了研究。首先通过生物信息学方法对灰葡萄孢BcJen1基因的氨基酸组成、疏水性、信号肽结构、亚细胞定位、产物功能、跨膜区域、二级结构预测和三级结构模拟、以及进化树和保守域进行分析,结果表明BcJen1基因编码产物是位于细胞膜上的跨膜蛋白,并且可能参与乳酸或其他羧酸的转运。通过Gateway技术构建Bcjen1基因敲除双元载体pCAMBIA-Bar-jen1,借助根癌农杆菌介导的T-DNA同源重组技术对灰葡萄孢进行了遗传转化,获得了3个稳定遗传的转化子,经PCR和RT-PCR分子鉴定确定2个为敲除突变株(Bcjen1-7和Bcjen1-9)和1个为异常插入突变株(Bcjen1-8)。本研究通过对野生型菌株和Bcjen1敲除突变株以及异常插入突变株生物学特性的测定和比对,对Bcjen1基因功能进行分析。实验结果显示Bcjen1敲除突变株较野生型菌株在PDA平板上生长速率没有差异,但野生型菌株在14 d后形成菌核而Bcjen1敲除突变株几乎没有菌核形成,Bcjen1敲除突变株的产孢量明显降低,野生型的孢子数量大约是敲除突变株的2.5倍,表明Bcjen1基因影响灰葡萄孢菌孢子和菌核的形成。与野生型相比,Bcjen1敲除突变株在3%乳酸平板上的生长变慢,生长速率下降了17.1%。在其他单羧酸(丙酮酸、乙酸)和二羧酸(苹果酸、延胡索酸和琥珀酸)平板上Bcjen1敲除突变株生长速率与野生型几乎无差异。这表明Bcjen1基因编码的蛋白产物可能参与乳酸的转运,对丙酮酸、乙酸和苹果酸、延胡索酸、琥珀酸等二羧酸没有转运能力。在番茄叶片上致病性检测结果显示Bcjen1敲除突变株对番茄叶片的侵染能力与野生型没有明显差异,说明Bcjen1基因对灰葡萄孢致病性没有影响。因此,可以推测Bcjen1基因可能参与乳酸的转运,并影响孢子和菌核的形成,但对灰葡萄孢的致病性没有影响。
【学位授予单位】:浙江工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S432.44

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