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《浙江工业大学》 2015年
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生物催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷D的研究

李铭敏  
【摘要】:甜菊糖苷(steviol glycosides,SGs)是甜菊叶片中提取的具有低热量、高甜度的天然甜味剂,不仅可作为食品添加剂,还具有一定的药用价值。甜菊糖苷均为双萜衍生物甜菊醇的糖苷,甜菊叶中已经发现的甜菊糖苷已经超过100多种,从甜度和回味等味质综合评价看,莱鲍迪苷D的味质最好。基于国内外研究进展,本实验旨在通过葡萄糖基转移酶的基因表达,在莱鲍迪苷A的C_(19)位侧链上转入一个葡萄糖基,特异性合成莱鲍迪苷D。首先,筛选获得了具有葡萄糖基转移活性的基因EUGT11,对其进行密码子优化、合成,并构建了pESC-LEU-EUGT11和pVTU26-EUGT11重组质粒。将重组质粒转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303-1A、Saccharomyces cerevisiae BY4741表达宿主中,成功地表达了目的基因。通过基因工程技术再次构建了一株具有葡萄糖转移酶活性Escherichia coli BL21(DE3)Codon Plus-RIL/pET-28a(+)-EUGT11菌株,诱导表达后,获得了大小为51kDa的目的蛋白。通过高效液相检测其酶活,从构建好的重组菌种筛选出一株相对酶活最高的菌株进行生物催化反应的条件优化。对该葡萄糖转移酶全细胞催化的研究发现:催化反应最适p H为7.0,稳定性和活力均达到最高。初始反应最适温度为35℃,在该温度下相对酶活最高;但温度稳定性不如30℃,在30℃、35℃和40℃下的半衰期分别为8.67h,4.99h和1.31h。添加金属离子和EDTA对酶活有一定的抑制作用。在最优催化反应条件下,即:在PBS缓冲液(pH 7.0、50 mM)中,反应温度35℃,底物浓度比例UDPG:莱鲍迪苷A=2:1(c/c),莱鲍迪苷A浓度0.25 g/L,细胞浓度60 g/L时,反应5小时,产率可以达到87.36%。该酶酶活为62.7U/g。
【学位授予单位】:浙江工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:TS202.3

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