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《浙江工业大学》 2015年
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3-羟基丙酸生产菌关键酶的分子改造及其构建表达

秦海彬  
【摘要】:3-羟基丙酸(3-HP)是一种重要的平台化学品,能够利用基因工程菌以甘油为底物进行发酵法生产。目前,文献报道的3-HP最高发酵产量为71.9 g/L,而有机酸的商业化生产需要达到100 g/L以上。因此,为了尽快实现3-HP的工业化生产,必须深入研究甘油生产3-HP途径中的限制性因素,提高关键酶的活性及底物转化率。本文以实验室构建保藏的菌株E.coli BL21(pET-28b-kgsadh)为研究对象,对其中的醛脱氢酶进行分子改造,研究了其酶学性质,并在此基础上成功构建了3-HP产生菌E.coli BL21(pCDFDuet-dhaB1-4,pET-28b-kgsadh)。主要研究结果如下:(1)根据KGSADH基因序列在NCBI上查找到相似性为40%的3JZ4(PDB ID)同源建模。利用已报道该酶的活性中心信息和能量分析软件,确定对KGSADH的氨基酸位点120E、163K、177K、219P、225K、252E、278K进行点突变。在以乙醛为底物时,带有突变点E120D、K177R、P219A的酶比活力分别得到较大提高,比酶活分别是原始酶的1.84、1.61和1.54倍。当采用两点组合突变KGSADH时,E120D/P219A突变酶的比活力得到最大提高,其比酶活是原始酶的4.22倍。后续同源建立突变酶E120D/P219A的蛋白模型,通过分子对接分析发现,突变后该酶的蛋白结构发生改变从而引起酶活的提高。(2)通过Ni-NAT柱对突变酶进行分离纯化,利用获得的纯酶研究醛脱氢酶突变前后的酶学特性:包括最适温度、热稳定性、最适pH、p H稳定性、金属离子、反应动力学参数等对其酶活的影响。结果表明突变后酶的最适温度为30°C,最适p H为8.0,且pH为6时的稳定性比原始酶有所增高。反应体系中添加金属离子时,Co~(2+),Fe~(3+),Fe~(2+)对酶活的促进作用比较大,而Zn~(2+)对酶活具有较大的抑制作用。原始KGSADH酶对乙醛的K_m为7.58 mM,V_(max)为10.6 U/mg。突变KGSADH酶对乙醛的K_m为6.28 mM,V_(max)为12.3 U/mg。(3)将甘油脱水酶DhaB1-4基因克隆到载体pCDFDuet-1上构建表达载体,并连同醛脱氢酶表达载体pET-28b-kgsadh转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中,成功构建共表达基因工程菌E.coli BL21/(pCDFDuet-dhaB1-4,p ET-28b-kgsadh)。对该菌进行诱导培养后发现,最佳的诱导时间为5 h,单酶DhaB1-4的酶活(109.3 U/mg)远高于KGSADH的酶活(6.3 U/mg)。当双酶共表达时,由于DhaB的不稳定性以及DhaB和KGSADH酶活力不均衡,导致DhaB1-4和KGSADH的酶活分别降为18.6 U/mg和2.8 U/mg。对该菌进行摇瓶发酵实验,结果表明发酵24 h后其生物量达3.98 g/L,残余甘油为10.6g/L,3-HP产量达6.0 g/L,是醛脱氢酶突变前的2.1倍。本课题针对3-羟基丙酸合成过程的关键限速酶醛脱氢酶进行分子改造,并在此基础上构建了一株3-羟基丙酸生产菌株,为解决3-羟基丙酸合成途径中的关键限制性因素,进一步提高3-羟基丙酸的产量奠定了一定的理论基础。
【学位授予单位】:浙江工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:TQ921

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