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《浙江工业大学》 2017年
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核受体介导的农药及其代谢产物的内分泌干扰效应研究

季晨阳  
【摘要】:我国是世界上农药生产和使用量最大的国家,农药的生态安全和健康风险一直是备受关注的研究热点。现有研究表明农药可以通过多种途径进入生态系统,在不同的环境介质中会形成数量众多、结构多样的中间代谢产物。但是农药中间代谢产物的风险还是农药风险评估和管理的一个盲点。内分泌干扰效应是研究最为广泛的污染物生态安全指标,但关于农药代谢产物的内分泌干扰效应的依旧十分缺失。本研究首先通过对斑马鱼胚胎毒性实验、细胞毒性实验研究了农药及其代谢产物的毒性效应,其次利用多种核受体介导双荧光报告基因系统、H295R体外模型及计算机辅助技术研究了由多种核受体介导的农药及其代谢产物内分泌干扰效应。本研究的主要工作和研究成果分为一下两大部分:(1)百菌清在斑马鱼体内代谢产物的检测及环境相关浓度下它们的胚胎毒性与内分泌干扰效应的研究。百菌清是一种年使用量十分巨大且环境残留较高的广谱杀菌剂。虽然使用量非常巨大,但是关于百菌清尤其是它的代谢产物对水生生物的潜在生态风险效应的研究仍然十分有限。在本实验中,我们选取了斑马鱼作为一种水生生物的体内模型,利用Q-TOF技术首次鉴定到了百菌清在斑马鱼体内的代谢产物——4-羟基百菌清;同时我还利用PCR方法探索了百菌清由肝脏细胞色素P450介导的生物转化机制。之后,我们利用体内体外模型全面地评估了百菌清及4-羟基百菌清的胚胎发育毒性及潜在的内分泌干扰效应。胚胎毒性的实验结果表明暴露96小时后,百菌清及4-羟基百菌清导致斑马鱼胚胎死亡的最低可见效应浓度均为50?g/L。在相同的50?g/L的浓度下,4-羟基百菌清对斑马鱼胚胎致死效应大约为百菌清的2.6倍。双荧光报告基因实验的结果表明百菌清和4-羟基百菌清都具有雌激素激动效应,其REC20值分别为2.4×10-8 M和3.6×10-8 M。但是,在甲状腺激素干扰效应方面,这样4-羟基百菌清即表现出了甲状腺激素激动效应又表现出了甲状腺激素拮抗效应。最后,我们利用分子对接技术来预测百菌清及4-羟基百菌清与雌激素受体和甲状腺激素受体作用强弱。对接的结果与双荧光报告基因实验的结果保持一致。总的来说,我们的研究表明4-羟基百菌清表现出了比母本化合物更强的内分泌干扰效应。实验结果提醒我们要更加关注对杀菌剂及其代谢产物潜在的生态健康风险的评价。(2)糖皮质激素受体和盐皮质激素受体介导的4种农药及其21种代谢产物的内分泌干扰效应的研究。吡丙醚、马拉硫磷、苯霜灵和恶唑禾草灵是四种目前仍在广泛使用的农药。由于其使用量大,在环境中会降解产生多种代谢产物,因此对这些农药以及它们代谢产物的生态健康风险效应评价具有重要的意义。在本实验中,我们以CHO-K1细胞系为模型,利用MTS法对比4种农药及其21种代谢产物的毒性效应;以双荧光报告基因系统来评价这些化合物由糖皮质激素受体和盐皮质激素受体介导的内分泌干扰效应。分子对接作为一种强大的工具被成功用于揭示目标化合物与糖皮质激素受体和盐皮质激素受体的识别位点相互作用的具体信息。另外,我们还采用PCR和激素测定这两个分析方法来全面地揭示目标化合物对H295R细胞内基因表达和激素分泌的影响并在原子水平模拟目标化合物与受体之间的相互作用情况。MTS实验的结果表明Pry-A,Pry-C,Pry-D,Pry-H,ML-A和BX-B均会对CHO-K1细胞产生细胞毒性,且ML-A的毒性最强,在10-8 M浓度下还能显著影响细胞活性。双荧光报告基因实验的结果显示,在检测的25种化合物中,仅Pry-F,Pry-G,ML,ML-A表现出了糖皮质激素拮抗效应。这四种化合物GR拮抗效应的强弱顺序为ML-APry-FPry-GML,其RIC20值分别为10-10 M,3.1×10-8 M,1.6×10-6 M和7.2×10-6 M。分子对接的结果也基本印证了双荧光报告基因的结果。PCR的实验结果显示,Pry-F,Pry-G,ML,ML-A的暴露会显著影响类固醇类激素合成转运相关的基因的表达,低浓度暴露下,3?HSD2,CYP11B1,CYP11B2等基因的表达量出现显著的上调。实验得到的数据将有助于我们更好的了解农药及其代谢产物可能造成的潜在生态健康风险。
【学位授予单位】:浙江工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:X592;X171.5

【参考文献】
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