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《浙江工业大学》 2016年
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立体选择性腈水解酶的筛选、分子改造及工业应用

张新红  
【摘要】:腈水解酶(EC 3.5.5.1)能催化腈化合物一步水解成羧酸和氨,反应条件温和、副产物少,是一类非常重要的工业用酶。以外消旋扁桃腈(R,S-MN)为底物合成高光学活性的(R)-扁桃酸(R-MA)是腈水解酶最重要的工业应用之一,该反应的立体选择性较高、起始原料廉价,并且底物理论转化率可达100%。R-MA作为重要的医药中间体,可用于合成头孢菌素、抗肿瘤剂、抗肥胖剂等,其本身也是一种重要的手性拆分剂。R-MA的生产方法包括化学法和生物酶法,其中,腈水解酶法催化R,S-MN合成R-MA的应用前景良好。本论文围绕立体选择性腈水解酶的筛选改造、工业应用及固定化三个方面展开。本论文首先以扁桃腈为主要底物,对实验室保藏的腈水解酶产生菌进行筛选,获得了一株具有较高活性和立体选择性的基因工程菌WtNit。为提高WtNit腈水解酶的活力,据其二级和三级结构、底物与酶的相互作用及目前的报道,共选取了5个氨基酸位点进行点饱和突变,结合pH指示-高效液相色谱(HPLC)两步高通量筛选方法,经过三轮突变获得了活力提高约200%的优良突变体Mut3。然后,对WtNit腈水解酶和Mut3腈水解酶进行了分离纯化和酶学性质研究。两个酶的最适pH均为8.0,最适温度均为45℃。在此条件下,Mut3腈水解酶的比酶活是WtNit腈水解酶的154%倍。动力学研究表明,WtNit腈水解酶的Km、Vmax和kcat分别为20.64 mM、33.74μmol mg-1min-1和24.45 s-1,Mut3腈水解酶的Km、Vmax和kcat分别为9.24 m M、47.68μmol mg-1 min-1和34.55 s-1。其次,对重组腈水解酶的应用进行了研究。全细胞催化(R,S)-MN生产R-MA的研究表明,用10 g/L的Mut3湿细胞催化100 mM(R,S)-MN生产R-MA,反应0.5 h,产率可达100%,然而,WtNit需1 h达到相同水平。底物分批补料研究表明,用50 g/L的Mut3湿细胞催化800 mM(R,S)-MN生产R-MA,反应7.5 h,R-MA的累积浓度可达693 m M。对Mut3在700 L、7000 L和20000 L发酵罐中的发酵进行了放大,对应的腈水解酶的比酶活分别为114.19、145.1和138.60U/g(DCW)。接着,R-MA的生产性试验在规模为500 L的反应器中进行,来自700 L、7000 L和20000 L发酵罐中的发酵液分别直接用于(R,S)-MN的催化,对应的R-MA的终浓度分别可达57.39、68.71和64.85 g/L。同时对反应液中R-MA的分离过程进行了优化,确定了R-MA的最佳分离条件:板框滤液的碱性pH调至10.0,用1:0.5(v水相/v有机相)的乙酸丁酯萃取一次获得水相,用H2SO4将水相调至pH 1.5,用1:2的(v水相/v有机相)的乙酸丁酯萃取30 min(萃取两次),脱色活性炭的用量为1.0%。在此分离条件下,R-MA的收率可达78.8%,纯度99%,ee99.9%。第三方面,为提高Mut3全细胞的操作稳定性,对其进行了固定化。对五类固定化方法进行了筛选,其中,戊二醛交联的DA/GA/PEI作为最佳的固定化方法,其固定化细胞的相对活力是游离细胞的135.95%倍。固定化细胞的操作稳定性研究表明,在35℃条件下,固定化细胞经过28批反应后,酶活仍然保留100%,而游离细胞经过10批反应后,活力仅保留8.79%。底物分批补料研究表明,用含有50 g/L Mut3湿细胞的固定化细胞催化832 mM(R,S)-MN,R-MA的累积浓度可达805.3 mM。通过对反应体系的温度和pH进行研究发现,固定化细胞和游离细胞的最适反应温度分别为50℃和45℃,最适pH均为8.0。储藏稳定性研究表明,固定化细胞在4℃条件下的酶活稳定性较好,而游离细胞为-20℃。为完成固定化细胞在填充床反应器中的研究,对其进行了造粒,条状和粒状固定化细胞的酶活基本一致,选择了10~18目的固定化细胞用于反应器的研究。固定化细胞在循环式填充床反应器中的反应条件为:填酶量为6.0 g,高径比H/D=2.8,底物流加速度为19 mL/min。串并联填充床反应器研究表明,反应器的结构对R-MA的产率没有显著的影响。固定化细胞在循环式填充床反应器中的操作稳定性较好,经过50批反应后,相对活力仍有78%以上。最后,为解决戊二醛在固定化过程中存在的问题,三羟甲基磷P(CH2OH)3(THP)代替戊二醛首次用于腈水解酶的固定化。对固定化细胞DA/PEI/THP的催化条件进行了优化,最适反应温度为55℃;在35℃、40℃和50℃时,对应的半衰期分别为1800 h、965 h和163 h;最适pH为8.0。底物耐受性研究表明,当底物浓度为300 mM时,固定化细胞DA/PEI/THP的比酶活是固定化细胞DA/GA/PEI的6.08倍。固定化细胞DA/PEI/THP催化(R,S)-MN生产R-MA的研究表明,用250 g/L固定化细胞催化500 mM R,S-MN,反应1 h,R-MA的浓度可达358 mM。底物分批补料研究表明,在40℃条件下,固定化细胞DA/PEI/THP催化(R,S)-MN合成R-MA的累积浓度(15 h,1.49M)高于固定化细胞DA/GA/PEI的(13 h,1.27 M),时空产率为363.70 g L-1d-1。为提高固定化细胞DA/PEI/THP的操作稳定性,对其进行造粒,造粒后的固定化细胞经过60个反应批次后,活力仍保留64%,R-MA的累积浓度可达5.69M。
【学位授予单位】:浙江工业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:TQ925

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