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《浙江工业大学》 2012年
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植物逆境相关转录因子CBF1对绿色木霉的转化及工程菌研究

陈勇  
【摘要】:丝状真菌木霉(TricHoderma)生存范围广、生长繁殖迅速,对其他真菌具有一定的拮抗作用,并具有能促进植物生长、诱导植物产生对病原菌抗性特点。因此农业上常将它作为防治植物病害的生防菌,而且它也是目前开发最成功的生防真菌。CBF1基因是植物中一个与耐低温相关的转录因子,目前在其他的丝状真菌中的作用还未曾报道。本文先从拟南芥cDNA文库中克隆出CBF1基因,并将它连进pENTRTM/D-TOPO?入门载体中,并最终通过Gateway LR反应将CBF1基因转移到表达载体ImpGWB502与带GFP标记的 ImpGWB505 中,构建成 ImpGWB502-CBF1 与ImpGWB505-CBF1-GFP表达载体,再将它们分别转化到农杆菌EHA105中,再利用农杆菌介导的转化方法(ATMT法)对绿色木霉(TrIchocderma viride)进行遗传转化。转化获得转CBF1基因的木霉CBF1转化子11株,转入融合GFP基因的CBF1基因的CBF1-GFP转化子7株,并对转化子进行了遗传稳定性分析及对CBF1基因的PCR验证。对CBF1转化子进行RT-PCR表达分析发现,该基因只在11株中的4株转化子得到表达。使用荧光显微镜对CBF1-GFP转化子进行观察后证明所有的转化子都能发出荧光。为了解CBF1蛋白在木霉细胞中的分布,本研究还将CBF1-GFP转化子放在激光共聚焦显微镜下进行观察,发现荧光在细胞内的分布情况与只转入GFP基因的转化子相同,均在细胞内均匀分布,说明CBF1蛋白并不像在植物中所报道的一样主要集中在细胞核内。最后,本文对验证有CBF1基因表达的两类转化子进行了抗逆表现型分析。将两类转化子接种在6%NaC1与1 mo1/L甘露醇PDA平板上,发现转化子的生长速度明显比野生型慢7%~12%,由此说明,CBF1基因没有提高绿色木霉的抗高渗胁迫压力的能力。而将两种转化子接种在PDA平板上并在4 ℃放置10 d,再置于23 ℃培养箱中放置24 h以后,CBF1-GFP转化子在平板上的生长直径比野生型大10%,而CBF1转化子除1株(4号)比野生型大12%以外,生长速率均比野生型低,暗示转CBF1基因的木霉提高了对低温胁迫的能力。而当把CBF1转化子接种在PDA平板,并在经37 ℃处理24 h之后,再在23 ℃生长4d之后,转化子的生长直径最高比野生型大65%,平均比野生型大60%。这说明CBFl基因在一定程度上提高了 CBF1转化子的抗高温胁迫的能力。木霉作为一种重要的生物防治菌,其防治效果受环境因素影响很大,特别是一些不利环境将严重影响它的生存。本文通过向绿色木霉中转入一个拟南芥中与抗逆相关的转录因子CBF1,经实验证明,CBF1基因对木霉的抗逆能力有一定的影响,特别是提高木霉应对高温胁迫的能力。而到现在为止,还没有报道有CBF1基因提高木霉抗逆能力的相关报道。本研究对提高木霉的适应环境的能力,进而提高生物防治能力,扩大木霉在农田中的使用,有着宝贵的理论意义。
【学位授予单位】:浙江工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S476.1

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