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《浙江工业大学》 2019年
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重组大肠杆菌发酵生产L-2-氨基丁酸的研究

李建强  
【摘要】:L-2-氨基丁酸(L-ABA)是一种非蛋白质氨基酸,作为重要的医药中间体用于众多手性药物的合成。近年来,在制药和化工领域,随着市场对L-ABA需求的增长,高效制备光学纯度高的L-ABA已经成为研究热点。本研究基于代谢工程技术,通过在Escherichia coli W3110中延伸代谢途径来构建基因工程菌株发酵生产L-ABA。L-ABA可以L-苏氨酸为前体经苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶催化而制得。本研究首先根据文献报道构建了L-苏氨酸的生产菌株E.coli THR,摇瓶发酵48 h可生产L-苏氨酸12.45 g/L。随后,将来源于E.coli W3110的编码苏氨酸脱氨酶的基因ilvA在E.coli THR中过量表达,获得生产α-酮丁酸(2-KB)的菌株E.coli THR/pTrc-ilvA,摇瓶发酵结果显示,E.coli THR/pTrc-ilvA能够代谢L-苏氨酸生产2-KB,产量为4.38 g/L,对基因ilvA进行定点突变(T1054G,T1055C,C1084T,G1085,T1086C,即F352A和R362F)解除L-异亮氨酸的反馈抑制后,菌株E.coli THR/pTrc-ilvA*可生产8.05 g/L 2-KB,产量提升了83.79%。接着将来源于芽孢杆菌(Bacillus cereus)和中间产热放线菌(Thermoactinomyces intermedius)的亮氨酸脱氢酶编码基因BleuDH、leuDH分别在E.coli THR中过量表达,得到菌株E.coli THR/pTrc-BleuDH和E.coli THR/pTrc-leuDH。摇瓶发酵结果表明,在额外添加10 g/L 2-KB的TPM培养基中,菌株E.coli THR/pTrc-leuDH能够更好地代谢2-KB生产L-ABA,产量为5.39 g/L,而同样条件下菌株E.coli THR/pTrc-BleuDH的L-ABA产量为3.16 g/L。最后,将筛选得到的基因ilvA*和leuDH在E.coli THR中串联共表达,初步构建获得以葡萄糖为原料可直接发酵生产L-ABA的菌株E.coli THR/pTrc-ilvA*-leuDH,在TPM培养基中35 ~oC下摇瓶发酵48小时L-ABA的产量为3.09 g/L。在菌株E.coli THR/pTrc-ilvA*-leuDH的基础上,为了避免L-苏氨酸分泌到胞外而得不到有效利用,编码L-苏氨酸外运蛋白的rht基因(rhtA和/或rhtC)被敲除,得到3株rht突变菌株,分别为E.coli THRΔrhtA/pTrc-ilvA*-leuDH、E.coli THRΔrhtC/pTrc-ilvA*-leuDH和E.coli THRΔrhtAΔrhtC/pTrc-ilvA*-leuDH。经摇瓶发酵可知,单独敲除rhtA基因时,L-ABA的产量最高,可以达到3.72 g/L,发酵液中L-苏氨酸的积累量也减少到0.22 g/L。但被代谢利用的L-苏氨酸并没有等价转化为L-ABA,为了驱使代谢通量流向L-ABA,乙酰羟酸合酶Ⅲ的编码基因ilvIH被敲除来阻断代谢竞争支路L-异亮氨酸的合成,获得菌株E.coli THRΔrhtAΔilvIH/pTrc-ilvA*-leuDH,L-ABA的产量提高到4.42 g/L。进一步,通过替换强度不同的启动子来调节基因ilvA*和leuDH在菌株E.coli THRΔrhtAΔilvIH中的表达量,筛选得到最优菌株E.coli THRΔrhtAΔilvIH/Gap-ilvA*-Pbs-leuDH,其在摇瓶中发酵可生产L-ABA 4.86 g/L,在5 L发酵罐中进行分批补料发酵60 h后,其L-ABA产量可达到9.33 g/L,产率为0.19g/L/h。本研究成功构建了直接利用葡萄糖生产L-ABA的工程菌株,为L-ABA的绿色工业化生产提供了一种有前景的方法。
【学位授予单位】:浙江工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:TQ922

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