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《浙江理工大学》 2010年 硕士论文
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家蚕细胞周期依赖性蛋白激酶家族(CDK)的研究

罗素娟  
【摘要】: 细胞周期依赖性蛋白激酶(Cyclin-dependent kinases,CDK)在真核细胞的细胞周期各种检验点的控制中发挥着重要作用,CDK类均为丝氨酸和苏氨酸类激酶,与相应的周期蛋白结合调控细胞周期的进程。在人体细胞中,控制G1期的主要是CDK2、CDK4和CDK6; S期和G2期依赖于CDK2;而M期主要由CDK1负责。CDK还有其它生物学功能,CDK5在神经细胞的突触形成中起关键作用,CDK7参与转录进程的调节,CDK8通过磷酸化RNA聚合酶Ⅱ羧基端结构域抑制转录的进行。 以果蝇和赤拟谷盗的CDKs的保守区为探针,检索家蚕EST数据库,共检索到八条与其同源的家蚕EST序列,应用DNAstar、ClustalX程序进行分类拼接,获得五个都具有部分CDK保守区的基因片段CDK4、CDK5、CDK7、CDK8、CDK9,组成一个基因家族。此外,发现CDK1序列已提交,CDK2 cDNA序列也通过生物信息学的方法进行了预测。其余五条cDNA序列的3'端不完整,且不能通过电子克隆的方法进行延伸。 分别利用RACE技术(cDNA末端快速扩增技术)和PCR技术克隆了家蚕CDK4、CDK5、CDK7、CDK8、CDK9五个基因的cDNA序列,补全了CDK7、CDK9的基因组序列。利用MEGA 4软件对家蚕、黑腹果蝇、红粉甲虫(赤拟谷盗)、意大利蜜蜂、埃及斑蚊、人类、大鼠等物种的CDK氨基酸序列进行了进化分析,发现每个物种中的各个CDK基因是独立起源的。利用Clustal X软件对家蚕CDKs氨基酸序列进行同源性比较,结果发现各基因均有一小段序列相当保守,即PSTAIRE序列,但不同的BmCDK基因该保守序列有所不同。 通过荧光定量PCR技术,在mRNA水平上监测了七个基因(CDK1、CDK2、CDK4、CDK5、CDK7、CDK8、CDK9)在家蚕五龄第六天幼虫十三个组织、胚胎发育过程中和杆状病毒BmNPV感染之后的表达模式。在五龄幼虫的十三个组织中,BmCDKs在中部丝腺、后部丝腺、马氏管、脂肪体中]mRNA拷贝数较多,而在血细胞和中肠中mRNA的拷贝数最少。在胚胎发育过程中,随着胚胎发育的进行,BmCDK在mRNA水平上的表达趋势逐渐降低,至第六天最低,随后在第七天开始回升,但都经历一个先降低又升高的波动性变化过程。感染病毒之后BmCDKs呈现与病毒粒子复制相关的变化规律。


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