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《浙江理工大学》 2010年
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家蚕BmycaCR基因的原核表达和亚细胞定位研究

刘静  
【摘要】: YcaCR蛋白含有一个保守的ycaC-related结构域,属于异分支酸酶超家族,据推测其功能可能与异分枝酸酶类似,但是具体底物和生物学功能尚不清楚。 从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中检索到一个EST序列,该序列编码一个含有ycaC-related保守结构域的蛋白的一个片断,进而得到该cDNA的全长序列。该序列被命名为BmycaCR,GenBank登录号为GU292794。预测该基因编码的蛋白分子量为22.838 kD。我们将其完整ORF序列克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建的重组质粒经PCR及双酶切鉴定成功后,转化到E. coli Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导成功表达了融合蛋白His-BmycaCR。超声破碎后发现该蛋白以可溶的形式存在于上清中,经亲和层析纯化后,得到较纯的融合蛋白His-BmycaCR。将纯化后的His-BmycaCR为抗原免疫新西兰大白兔后制备该蛋白的多克隆抗体,经ELISA检测,抗体效价可达1:6400以上。我们还采用荧光定量PCR和Western blot的方法,对BmycaCR在家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾四个发育时期以及五龄幼虫各组织中的转录水平和表达情况进行分析,结果显示:在各发育时期中,BmycaCR基因在卵时期的转录水平和表达量最高,而在蛾时期的转录水平和表达量最低,在家蚕五龄幼虫各组织中,BmycaCR基因的转录水平由高到低依次为睾丸、气管、脂肪体、卵巢、表皮、肠、血、马氏管、丝腺、头部;在五龄幼虫的各组织中,该蛋白在睾丸、马氏管、气管、卵巢、表皮、肠和脂肪体中均有表达,而在头部、血和丝腺中未检测到阳性信号。亚细胞定位结果表明,BmycaCR蛋白在家蚕BmN细胞的细胞核和细胞质中均有分布,但在靠近质膜区域检测到较强的荧光信号。研究结果为以后研究该蛋白的功能特性奠定了基础。
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