人工合成荧光蛋白的表达、性质鉴定和亚细胞定位及其突变体的构建和性质鉴定

【摘要】： 荧光蛋白易于和其他蛋白融合,且融合后的荧光蛋白具有保持荧光激发活性的优点,其被广泛地应用于细胞学、医学和分子学领域。然而,荧光蛋白研究方法的发展对荧光蛋白的种类也提出了更多的要求。而传统的获得荧光蛋白的方式主要局限于从生物体内直接提取或通过定点诱变和突变的技术来获得,而对利用基因合成的方法合成新型荧光蛋白的研究则很少。 本文在利用微流体PicoArray芯片合成荧光蛋白寡核苷酸和体外组装的基础上,获得了荧光蛋白全长大小的一系列基因片段,然后将基因克隆到融合表达载体pET-28a(+)中,筛选后得到融合有荧光蛋白的表达质粒pET-28a(+)-FP,(本文主要对其中三种荧光蛋白B11,E6和H3进行性质鉴定)经鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,根据荧光蛋白表达的影响因素进行了荧光蛋白表达条件的优化,获得了荧光蛋白的最佳表达条件,然后利用终止蛋白表达和不同时间点取样测定荧光强度的方法获得了荧光蛋白的成熟时间。在荧光蛋白最佳表达条件和成熟时间的基础上,对荧光蛋白进行大量表达,并利用Ni-IDA亲和层析的方法对FP-His tag进行初步纯化和FPLC分子筛进一步纯化后,得到了纯化度在95%之上符合后续性质鉴定的荧光蛋白。质谱结果显示三种荧光蛋白的分子量和理论值相符。吸收光谱结果显示B11,E6的光吸收峰分别在484 nm、547 nm;H3的吸收峰有两个分别为385 nm和501 nm,说明H3在其荧光发色基团成熟过程中经历较长的中间体阶段;荧光蛋白的激发光谱和发射光谱结果显示B11,E6和H3的最佳激发波长和发射波长分别是484 nm,510 nm;535 nm,560 nm和540 nm,565 nm,即荧光蛋白E6和H3属于较长波长的荧光蛋白。对比B11,EBFP和EGFP荧光蛋白的光谱学性质,并结合其三级结构推论出B11的第145位残基对其量子产率有重要的作用,设计引物引入突变点F145Y,经过分段PCR和重叠PCR得到含有目的突变位点的荧光蛋白基因的全长片段,经鉴定后表达并纯化B11突变体,测定其量子产率,结果显示B11突变体的量子产率是0.24大于B11的量子产率(0.18),结果和推测相符。为了证明获得的荧光蛋白是否可应用于哺乳动物Hela细胞,构建了pcDNA3.1(+)-G2-HexaHis真核质粒载体,转染Hela细胞后显示有很强的荧光信号,激光共聚焦显微镜观察发现,荧光蛋白主要分布在Hela细胞质中。以上结果证实了人工合成获取新荧光蛋白方法的可行性,同时获得的荧光蛋白性能优良是蛋白定位,基因转录强度测定,蛋白相互作用等领域和荧光共振能量转移,荧光蛋白多标签技术研究中很有潜力的备选工具。