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《浙江理工大学》 2010年
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两个家蚕FKBP12基因的研究

费晶晶  
【摘要】: FKBPs是免疫抑制剂FK506的胞内受体蛋白,这些蛋白参与多种生理学作用,包括蛋白折叠,T细胞激活的抑制调节,以及细胞周期抑制等。12 kD的FKBPs蛋白是其代表性成员,在各物种细胞内广泛表达且高度保守,具有PPIase活性。目前只是发现在脊椎动物中有多个FKBP12亚型,而我们通过NCBI家蚕基因库中找到两条完整编码家蚕FKBP12蛋白的nRNA序列,命名为Bm-FKBP12A和Bm-FKBP12B,基因登录号分别为DQ443197和DQ443423。多物种序列比对发现,FKBP12同源基因以及同源异性基因在氨基酸水平上具有高度的相似性,Bm-FKBP12A蛋白与人的FKBP12蛋白同源性为77%Bm-FKBP12B蛋白与人的FKBP12蛋白同源性为73%,Bm-FKBP12A和Bm-FKBP12B之间的相似性为83%。Bm-FKBP12A蛋白推测的的分子量、等电点分别为11.82kD和7.86,Bm-FKBP12B蛋白的分子量、等电点分别为11.63kD和8.79,这些特征与已知的FKBP12蛋白相似。 将两种FKBP12基因的cDNA序列与家蚕全基因组序列进行比对,两个基因都由3个外显子和2个内含子组成,但Bm-FKBP12A基因的内含子序列要比Bm-FKBP12B长。通过在线网站分析了Bm-FKBP12A和Bm-FKBP12B的启动子序列并对两个基因进行了染色体定位预测,发现两个基因都定位在20号染色体上,距离相差1500kbp。Bm-FKBP12A在5′端上游(-361)—(-311)bp的区域有一个启动子序列,Bm-FKBP12B在5′端上游(-161)—(-121)bp的区域有一个启动子序列。组织特异性顺式作用元件没有在Bm-FKBP12A和Bm-FKBP12B基因中发现,说明家蚕FKBP12蛋白在各组织中广泛表达。 Bm-FKBP12B基因的ORF被克隆到pGEX-4T-3载体中,在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白GST-Bm-FKBP12B,通过GST亲和层析,得到较纯的融合蛋白GST-Bm-FKBP12B,凝血酶将融合蛋白中的GST切除后,再通过分子筛SephadexG-75进一步纯化。将经过纯化的Bm-FKBP12B作为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA检测该抗血清的效价达到1:12800以上。对纯化的Bm-FKBP12B蛋白进行了PPIase活性测定,结果显示具有较高活性。通过相似EST搜索、实时荧光相对定量PCR和Western blotting分析了两种FKBP12蛋白在家蚕各个时期的表达以及各个组织的分布。发现Bm-FKBP12存在于家蚕各个组织及各个时期,Bm-FKBP12A的转录本在各个组织均比Bm-FKBP12B高,而Bm-FKBP12B的转录本在蛾期和胚胎期最高。Western blotting显示FKBP12在丝腺和肠的表达最高,暗示在吐丝前期FKBP12蛋白可能对丝腺的基因表调控以及丝蛋白的形成具有重要作用。GST-Pull down显示家蚕FKBP12与Hmo1蛋白不能发生体外互作。以上这些结果为深入研究家蚕FKBP12基因奠定了基础。
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